嵌合抗原受体自然杀伤细胞(CAR-NK)促进实体瘤和恶性肿瘤的现成细胞治疗。然而，CAR-NK的发展由于其免疫监视的不确定性和细胞毒性挑战而受到限制。自然杀伤细胞衍生外泌体(NK-Exo)将NK细胞治疗的关键靶向细胞疗法与独特的无毒Exo结合起来，作为抗癌免疫治疗的自源穿梭体。本文综述了细胞因子、过继性(自体和异体)NK免疫治疗、刺激和调节功能以及NK细胞的无细胞衍生物。考虑非caspase独立/依赖的细胞凋亡和Fas/FasL通路的NK-Exo细胞毒性和抗肿瘤活性在癌症免疫治疗中的未来路径最后，详细讨论了NK-Exo联合治疗的意义和意义，以及纯化和递送NK-Exo到严重免疫和肿瘤细胞和组织的新方法的发展。
自然杀伤细胞是先天免疫的一个组成部分，由大量的颗粒淋巴细胞组成。这些细胞被认为是负责免疫监视的最有效的免疫细胞，因为与其他淋巴细胞(如t细胞)不同，它们不受靶细胞中主要组织相容性复合体(MHC)或人白细胞抗原(HLA)表达的限制，可以在不引发的情况下清除转化或感染的细胞[1]。
NK细胞建立了溶解机制，它可以通过各种化学引诱剂向炎症部位迁移，并独立于先验激活而破坏靶细胞[2]。因此，它们在抑制肿瘤生长和转移扩散以及防御各种病原体等肿瘤标志中发挥主导作用[3]。因此，由于外周血NK细胞活性低，可增加患癌风险[4]。
人们正在努力了解NK细胞是否有足够的活力、更好的生长和适当的活化，以便用于具有酸性欲望的癌症免疫治疗(CI) Exos[5,6]。
在免疫系统细胞中，来自骨髓(BM)中CD34+造血祖细胞[7]的NK细胞受到了更多的关注。这些细胞通常存在于血液、肝脏、脾脏、骨髓和淋巴结中。然而，肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)中的炎症因子可以刺激NK细胞向大多数组织迁移。这些细胞不需要预先免疫来发挥细胞毒性作用，它们的亚群寿命很长。它们可以在特定的刺激条件下产生类似记忆的反应。因此，NK细胞被认为是先天免疫和适应性免疫之间的桥梁之一[8]。此外，NK细胞被认为是CI中的抗肿瘤疫苗，因为它们能够快速检测和溶解肿瘤细胞，而对其他体细胞的影响有限[9]。一方面，来自外周血的NK细胞在淋巴细胞门内CD3阴性时可被CD56表达识别。它们可以进一步分为细胞毒性CD56-dim-CD16-bright，其中包含90%的生理状态下呈现的NK细胞，CD56-bright-CD16 +中包含10%的NK细胞产生的干扰素γ (IFN-γ)[10]。
近年来，不同亚型的细胞外载体(EV)，包括细胞膜源性微囊泡(MV) (150 - 1000nm)、凋亡小体(1000 - 5000nm)，尤其是通过免疫细胞释放的Exos (50 - 150nm)[11]，被认为是CI中具有以下特征的无细胞替代品[12,13]。首先，由于肿瘤的血管渗漏，被动组织的潜能扩散;第二，exo们喜欢酸性环境;所以它们可以保持在酸性的TME，这促进了Exos与恶性细胞的融合。此外，由于它们的纳米尺寸，它们可以跨越生物屏障。最后，Exos在- 80°C下可稳定保存约一年，因此可作为“现成的”处理方法进行高效储存和使用[5,14]。另一方面，NK细胞可以通过在纳米级EV中的包封过程释放可溶性药物[15]。在各种生理条件和癌症中，外显子是细胞间通讯的关键介质，主要在转移、癌症进展和免疫反应中起作用[16]。此外，免疫细胞可以将具有耐受性和刺激性特征的Exos释放到细胞外环境，支持免疫细胞源性Exos在癌症治疗中的潜力[17]。为此，由于Exos对生物流体的详细探索，人们对将其作为生物标志物的兴趣越来越大。就像最近报道的黑色素瘤患者的程序性死亡配体1+ Exos一样[18]。提高对精准医疗的渴望的努力集中在基于先天和适应性免疫系统促进反应的疗法的发展上[19]。外显子可以调节特定的细胞活动，如血管稳态和抗原呈递[20]，并表现出低免疫原性和高运输效率，从而建立了外显子在CI中的应用[21]。
免疫细胞，包括树突状细胞(DC)、T细胞和NK细胞，衍生的Exos可能在癌症免疫调节中发挥关键作用[22]。带有抗原肽的外显子诱导抗肿瘤CD8+ T细胞反应。为此，dc衍生的Exos可以抑制肿瘤细胞和nk -Exos介导的原发肿瘤的监视，因此可以抑制肿瘤细胞的异常增殖[23]。随后，为了探索将Exos用于个性化医疗中NK疗法的发展，NK-Exos是CI中的一门创新艺术。本文综述了基于NK的CI的障碍和优势，包括使用基于细胞因子的治疗和改善过继NK细胞免疫治疗的功能表现，以及NK- exos作为调节和刺激免疫系统的穿梭体的操作。本文讨论了具有CI靶标记的NK-Exos的发展和特点。
与其他淋巴细胞不同，NK细胞不表达抗原特异性受体。相反，它们表达基因组编码的刺激或抑制受体[24,25]。NK细胞的效应功能受这些激活和抑制受体的信号调节，以避免对宿主产生潜在的危险作用[26]。NK细胞上的主要激活受体包括天然细胞毒性受体(NCR) (NKp30、NKp44和NKp46)、c型凝集素受体(CLR) (CD94/NKG2D、NKG2C、NKG2E/H和NKG2F)、NK相关CLR (NKp65、NKp80)、低亲和力IgG受体FcγRIII (CD16)、SLAM(一组I型跨膜受体)家族受体(2B4、SLAM6和SLAM7)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR) (2DS和3DS亚型)、IgSF成员DNAX辅助分子-1 (DNAM-1)和CD137 (4-1BB)[27]。
抑制受体识别自身mhc - 1分子，包括2DL和3DL亚型以及CD94/NKG2A/B等CLR。此外，程序性死亡-1 (PD-1)[28]、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4 (CTLA-4)[29]、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域-3 (TIM-3)以及具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)受体等免疫检查点(ICP)也会传递抑制信号。通常，健康细胞中表达的HLA-I分子(HLA-I)与NK细胞上的KIR或CD94/NKG2A/B配对，抑制NK细胞的杀伤作用[30]。
肿瘤细胞通过表面抗原变化来逃避免疫反应。例如，在神经母细胞瘤中，hla - 1缺失或下调。另一些激活NK细胞受体配体，可同时抑制T细胞和NK细胞[31]。肿瘤细胞缺乏hla - 1表达(“缺失自我”识别假说)消除了通过KIR或CLR受体传递的抑制信号[32]。
免疫应激增加肿瘤细胞中的损伤相关蛋白。MICA/MICB、ULBPs、B7-H6、BAT3、CD155、CD112等蛋白可与NK细胞激活受体偶联，启动NK细胞的细胞毒性功能。NK细胞同时接收到激活和抑制信号。下一步，这些信号的整合决定了NK细胞活化的结果[33]。
活化的NK细胞可直接或间接地对恶性肿瘤细胞发挥细胞毒作用。直接法涉及多种机制，包括释放带穿孔素(PFN)和颗粒酶(Gzm)的裂解溶酶体，由于死亡受体的特性而诱导细胞凋亡。在这些死亡受体中，Fas (CD95/APO-1/TNFRSF6)相关死亡结构域(FADD)在Fas- fasl(配体)附着引发的细胞凋亡诱导中起重要作用。这种相互作用招募FADD并结合procaspase-8，从而形成死亡诱导信号复合体(DISC)和caspase-8活性效应物caspase-3[34,35]。其他受体包括肿瘤坏死因子(TNF)相关的凋亡诱导配体(TRAIL)和抗体(Ab)依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)诱导，通常由CD16 (FcγRIIIa)介导。在间接途径中，NK细胞通过分泌细胞因子，特别是IFN-γ，趋化因子如CCL4和CCL5，以及生长因子如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和腺苷来改变免疫系统的细胞毒性活性[36]。
NK细胞在先天免疫系统中也表现出非特异性抗原训练免疫(记忆和记忆样功能)，分为半抗原特异性、病毒特异性和细胞因子诱导的三类[37]。细胞因子诱导的记忆样(CIML) NK细胞是过继细胞免疫治疗策略中有吸引力的细胞类型，尤其是CI[38]。经过IL-12、IL-18和IL-15细胞因子的短暂预刺激后，人类NK细胞表现出类似记忆的特性[39]。在这些细胞中，再刺激后CD25表达升高，KIRs和TGF-β表达降低，INF-?产生增加。此外，还报道了CpG去甲基化、代谢变化(尤其是葡萄糖转运体和转铁蛋白受体向糖酵解方向变化)、体内增殖能力增强、细胞毒性颗粒成分改变以及体内长期持续性等流行变化。这些特征可能导致CIML NK细胞释放抑制，增强抗肿瘤反应，并具有长期的持久性和回忆功能[37,40,41]。
NK细胞存在于免疫应答的第一线，对转化细胞和应激细胞做出快速反应[42]，同时具有一些特征，如炎症细胞因子的快速释放，无需预先免疫即可作用于杀伤细胞，在某些条件下获得免疫记忆，以及多种来源的存在，如自体、异体和外周血单个核细胞、干细胞、细胞系，并对NK细胞进行基因修饰以获得它们，导致越来越多的基于NK细胞的CI研究[43,44]。用于NK细胞癌症治疗的几种方法包括细胞因子、抗体、未修饰NK细胞的过继转移、NK细胞系的过继转移、转基因NK细胞的过继转移以及NK细胞无细胞衍生物的使用[45,46]。图1为NK细胞免疫治疗的有效策略。在第一种策略中，患者接受刺激细胞因子治疗，刺激细胞因子促进NK细胞增殖和活化，以更好地抗肿瘤反应。其次，Abs要么激活NK细胞和ADCC，要么通过抑制NK细胞抑制受体促进NK细胞的细胞毒活性。在采用过继NK细胞免疫疗法的第三种策略中，NK细胞(自体、同种异体、细胞系或CAR NK细胞)在体外被激活和扩增，然后输注到患者体内以改善免疫反应。最后，在最后一种方法中，Exos用作无细胞CI来克服直接细胞使用的限制。
图1
NK细胞免疫治疗策略。NK细胞免疫治疗的不同策略。首先，用细胞因子治疗促进NK细胞增殖和活化;其次，用抗体或抑制性受体处理NK细胞和ADCC的活化或促进NK细胞的细胞毒活性;第三，过继NK细胞免疫治疗(自体或同种异体NK细胞转移);第四，NK细胞的无细胞衍生物(Exos)治疗克服了直接细胞使用的局限性
细胞因子可以用来促进NK细胞对恶性细胞的反应。它们的作用机制是通过直接或间接刺激NK细胞。细胞因子直接改善体内NK细胞的数量、分化和活化。第二种途径是准备NK细胞用于过继转移的初步步骤。在这种方法中，NK细胞在体外增殖和激活后，与一种或多种细胞因子混合培养[45]。一些临床试验已经评估了有效的细胞因子对NK细胞反应的影响，包括IL-2、12、15、18和21[47]。最初的临床试验使用il -2活化的NK细胞治疗恶性细胞[48]。细胞因子激活的NK细胞凋亡及其全身给药毒性是细胞因子用于CI中NK细胞的主要局限性。似乎细胞因子组合，IL-2或IL-15与IL-12或IL-8，由于协同作用，增加NK细胞凋亡与它们的激活水平相关[49]。克服这些限制的一种治疗策略是在CI中使用具有协同抗肿瘤作用和不完全重叠毒性的细胞因子与脉冲剂量联合使用。同样，有影响的生长因子(如Flt3-L、SCF和IL-7)也被认为与NK细胞激活因子一起参与NK细胞分化的早期阶段。这些生长因子还可以增加未成熟和成熟NK细胞的数量[50]。表1总结了有效细胞因子在NK细胞治疗中的作用和功能，以及它们的优缺点。
表1有效细胞因子在NK细胞治疗免疫通路中的作用和功能
基于NK细胞的抗体治疗有三种类型:肿瘤特异性抗体，靶向ICP的抗体以抑制NK细胞的释放，以及双特异性或三特异性杀伤接合物以增强NK细胞接合物(NKCE)。利用肿瘤特异性抗体，肿瘤特异性单克隆抗体(tumor-specific monoclonal antibodies, mAbs)可识别肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原。这些单克隆抗体通过不同的机制攻击恶性细胞，包括将有毒分子传递到靶细胞，并通过与CD16 (FcγIIIA)激活受体相互作用促进NK细胞(ADCC)杀死靶标[51,52]。在第二种方法中，NK细胞防止过度激活并表达ICP受体，如PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、CD96、IL-1受体8、KIR和CD94/NKG2A。这些受体的配体由恶性细胞表达以逃避免疫系统。因此，使用抑制这些受体的单克隆抗体，抗pd -1和抗pd - l1可以立即释放细胞生长的刹车，增强NK细胞的抗肿瘤活性[53]。最后，NKCE由单链可变片段(scFv)组成，旨在在活化的NK细胞和肿瘤细胞之间形成抗原免疫突触，以增强NK细胞的肿瘤靶向性和细胞毒性[4,54]。NK细胞过继性转移是一种通过注入自体、同种异体细胞系和嵌合抗原受体(CAR)来替代、修复和改善免疫系统功能的方法，CAR由细胞外抗原识别域融合到细胞内信号域，重定向免疫细胞的特异性和功能[55]，NK细胞因其独特的抗肿瘤特性而成为适应性免疫治疗的合适且有前景的细胞[56]。
在NK细胞过继转移策略中，采用了多种创新的方法来分离、扩增、操作或产生体外活化的自体或异体NK细胞，并将其给予患者以对抗肿瘤[57]。这些细胞从患者或健康供体外周血、干细胞(诱导多能干细胞、人胚胎干细胞或造血干细胞)等多种来源分离或分化，建立人类细胞系，然后用不同的方法扩增到充足和大规模[58,59]。成功NK细胞治疗的挑战之一是能否从不同来源的有限数量的NK细胞中获得大量细胞[60]。目前正在进行研究，以改进克服这些障碍的方法。例如，新鲜NK细胞传统上用于治疗，但现在，成熟NK细胞的冷冻保存是可能的。在扩增阶段，不同的实际方案结合无血清培养基、补充物、重组细胞因子、刺激抗体、小分子、药品和辐照饲养细胞。对于临床程序，动物血清产品不再使用，此外，组织培养瓶已经让位于生物反应器系统或专用GMP设施中的培养袋。饲养细胞也通过提供细胞间通讯在NK细胞的扩增中发挥重要作用[61]。尽管研究不断寻找新的方法来减少对饲养细胞的依赖，提高NK细胞扩增的效率，例如，使用两种异二聚体多细胞因子融合物进行NK细胞增殖和活化[62]。
使用NK细胞作为过继细胞疗法治疗癌症的早期试验发生在20世纪80年代。这些试验基于淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)的递送[63]。然而，由于IL-2的高剂量使用，其临床效果较差，副作用严重[64]。临床试验表明自体NK治疗是安全且普遍的，但由于转移对肿瘤抑制的限制，其疗效有限[65]。同样，由于肿瘤细胞表达自身hla - 1，并通过il -2诱导的调节性T细胞(Treg)识别NK细胞kir或直接NK细胞毒性，从而抑制NK细胞杀伤作用[66]。因此，诸如使用抗kir Ab来阻断NK细胞抑制受体与其靶细胞上的hla - 1配体相互作用的策略已经被开发出来以克服这些局限性[52]。
由于自体NK细胞的局限性，利用相关健康供体的同种异体NK细胞代替自体NK细胞进行过继性移植治疗。这些同种异体细胞在非免疫抑制环境中接受教育，使其在移植前完全发挥功能。此外，这些细胞可以作为现成的同种异体产品用于即时临床使用[67]。同种异体细胞治疗最关键的危害是移植物抗宿主病(GVHD)的发展。然而，与T细胞相反，同种异体NK细胞，特别是单倍体NK细胞，由于NK细胞上缺乏表面T细胞受体(TCRs)，从而提高了转移效率并降低了相关毒性，因此不会诱导GVHD[68,69]。异体NK细胞治疗，特别是在转移期，已经进行了临床评估，但仍然没有标准的方案或产品[68,69]。
与其他CAR细胞(CAR - T)相比，CAR - NK在体外和体内均表现出更好的肿瘤特异性靶向和细胞毒性，并具有靶向免疫治疗的特点。首先，与CAR - T细胞不同，由于同种异体NK细胞不会引起GVHD，因此它们不需要HLA匹配。其次，CAR - NK没有克隆扩增;因此，它们不会诱发细胞因子风暴。另一方面，NK细胞主要释放IFN-γ和GM-CSF;因此，它们的细胞因子产生谱被认为是安全的。第三，由于NK细胞的来源多种多样，如外周血、脐带血、人胚胎干细胞、诱导多能干细胞，甚至NK细胞系，因此CAR - NK细胞的生产比CAR - T细胞更便宜、更省时[70,71,72]。最终，CAR细胞具有长期的持久性，这增加了自身免疫或恶性肿瘤的风险，因为NK细胞是短命的。CAR - NK细胞有望在其抗癌作用的中介作用后迅速消失，并且它们不需要“自杀系统”来清除细胞[73]。尽管car表达NK细胞的生产有这些好处，但它也面临着大量NK细胞(尤其是外周血NK细胞)难以分离和扩增、细胞低温保存的敏感性和转染效率低等问题。因此，NK细胞系引起了人们的关注，因为NK细胞系由完全活化的NK细胞组成，易于转染，并且在适当的生产条件下可以很好地扩增[74,75]。
在公认的NK细胞系中，只有NK-92细胞被FDA批准用于临床应用。NK-92细胞的安全性和可行性已被不同的临床试验所证实[76]。NK-92是一种纯同种异体活化NK细胞源，依赖于IL-2，对各种恶性肿瘤具有细胞毒性，没有KIR[77]。这些细胞比供体来源的原代NK细胞更容易增殖(在GMP条件下)，使其具有成本效益[78]。此外，它们可以用各种载体进行操作，以增加它们的靶向、归巢和细胞毒活性。尽管有这些优势，NK-92细胞的疗效仍然有限，原因有几个，如寿命有限，有效性低，并且由于肿瘤组织起源，需要在注射前进行照射以完全撤销其增殖，这严重影响了它们在体内的持久性。虽然反复注射似乎有帮助，但它们会刺激免疫系统对抗NK-92细胞中表达的HLA，从而增加这些细胞的清除[79]。
尽管在CI中使用NK细胞取得了许多进展，但直接细胞的疗效充其量是中等的。有效性限制的原因包括转移NK细胞在体内的持久性有限，与其他免疫系统细胞相比，NK细胞向肿瘤组织的迁移和渗透能力有限，NK细胞在肿瘤细胞中逃逸机制的进化，最后，NK细胞受到Treg、髓源性抑制细胞(MDSC)中的TME成分的抑制，导致NK细胞功能受到抑制，转化生长因子-β (TGF-β)、腺苷、前列腺素E2 (PGE2)和吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)与NK细胞功能障碍相关[80]。
摘要
背景
CI中的NK细胞:障碍与优势
NK细胞免疫治疗策略
外泌体的治疗潜力
nk来源外泌体在癌症和癌症免疫治疗中的表现
结论
数据和材料的可用性
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外显子在处理病原体和感染发病机制中起双重作用。此外，来自受感染细胞的Exos可以将病原体相关分子模式(pathogen associated molecular patterns, PAMPs)传递给周围细胞，特别是针对细胞内病原体，并刺激抗菌免疫反应[81]。外显子是由核内体向内出芽产生的，核内体在多泡体(MVB)内包装和运输货物[82](图2)。外显子生物发生的标志首先是质膜上的内吞事件。从早期核内体到晚期核内体成熟后，核内体膜向内出芽形成腔内囊泡(inaluminal vesicles, ILV)，产生MVBs[83]。MVB通常转化为溶酶体(降解MVB)，其中旨在破坏的蛋白质被富集。然而，一些胞外MVBs (exocytic MVBs)采取另一种途径，移动到质膜，并通过与质膜融合，在细胞外空间以Exos的形式释放ILV货物[84]。
图2
外泌体生物发生过程。外泌体从来源到输送的整个过程。从蛋白质和脂质复合物的内化开始;然后继续向内出芽的核内体包装和运输货物在多泡体(MVB)内。最后，Exos从细胞中释放出来，经分离和鉴定后可用于治疗。NK，自然杀手;IL,白介素;mAb，单克隆抗体;CAR - NK，嵌合抗原受体-自然杀手
至少有两种不同的途径介导胞外MVB的生物发生过程，并涉及将各种分子分选为ILV[85]。导致MVB形成的第一个途径需要运输所需的内体分选复合体(ESCRT)。第一个模型表明，Exos是在内吞途径中以两步过程形成的，并在细胞外环境(如内囊泡)中通过MVBs从质膜释放出来[86]。事实上，通过这种方式，外显子是通过内体腔室膜向内出芽，形成腔内小体，利用内体ESCRT的机制产生的[87]。这种异聚蛋白复合物(ESCRT-0、-I、-II和-III)在MVBs的形成、分选和分泌中起着关键作用。ESCRT-I、-II和-III识别单泛素化产物和可能的gpi锚定产物，然后促进它们在MVBs中的包含。一旦完成，ESCRT复合物在腺苷三磷酸酶液泡蛋白分选4 (Vps4)的帮助下从MVB膜上解离，并为后续货物回收[88]。
第二种分泌途径是不依赖escrt的机制。在这种方法中，蛋白质如转铁蛋白受体存在于ILV中，但不泛素化。这些缺乏泛素化分选信号的蛋白质根据其固有的物理性质和倾向于分离成筏状微结构域的倾向被划分到ILV中[86,89]。研究表明，几种Rab家族蛋白(gtpase)，包括Rab27、35和11亚家族，在这些方面起着重要的外显子转运和分泌调节作用。它们与钙一起参与MVB与质膜的对接和融合[90,91]。在这方面，Exos的展示使我们能够创建携带细胞因子或肿瘤抗原的重组囊泡，这些细胞因子或肿瘤抗原可能之前不存在于Exos上[92]。该技术用于诱导针对肿瘤生物标志物的表位特异性Ab反应。这种名为ExoMAb的Ab方法为我们提供了设计新疗法和产生新型诊断工具的新机会[93]。
DC-derived-Exos (Dex)具有功能性mhc - i肽[94]复合物，可诱导小鼠CD8+ T细胞依赖性抗肿瘤免疫反应。这一发现和其他类似的结果构成了外显子在细胞间通讯假说中活跃作用的基础，至少在免疫系统中是这样。(95、96)。在抗原特异性免疫应答中，Exos可以增加DC呈递它们的数量(图3)，或者通过传播起源细胞(病原体感染细胞、肿瘤细胞和表达炎症细胞因子的细胞)抗原或将mhc肽复合物呈递它们，直接与记忆T细胞相互作用。这种扩散的结果取决于DC捕获Exos的状态(特别是来自非应激或未感染的未成熟DC或肿瘤的Exos)和Exos携带的分子(例如，来自成熟/感染/应激细胞的促炎信号或来自某些非应激肿瘤的免疫抑制信号)[97]。
图3
外泌体对免疫系统的免疫调节作用。在抗原特异性免疫应答中，Exos扩散并呈递原细胞抗原，从而增加呈递这些特殊抗原的DC细胞的数量。在接下来的研究中，该DC衍生的exos (Dex)通过与CD4+和CD8+ T细胞相互作用诱导抗肿瘤免疫反应。肿瘤源性Exos可能具有NK细胞毒性活性抑制、T淋巴细胞增殖减少、抑制性骨髓细胞分化增加、促进Treg扩增分化等免疫抑制作用
通过Exos进行的T细胞活化分析表明，Exos中的mhc -肽复合物直接结合其同源T细胞受体并激活引物CD4+和CD8+ T细胞(图3)。另一方面，幼稚T淋巴细胞需要捕获Exos并将外泌体mhc -肽复合物呈现给特定T细胞的dc。这种差异可能是由于淋巴细胞功能相关抗原(LFA-1)整合素在启动T淋巴细胞表面的激活构象，这使得携带细胞间粘附分子-1 (ICAM1)的Exos与这些T淋巴细胞有效结合，就像它与表达LFA-1的DC一样。这也反映了幼稚T细胞需要DC分泌的细胞因子和tcr依赖信号才能激活。这些免疫效应可用于各种治疗，如抗癌[98]。
Exos除了具有免疫刺激作用外，还具有促进免疫系统耐受的能力，如图3所示。未成熟DC或DC经免疫抑制治疗或修饰表达免疫抑制细胞因子后分泌的Exos单独注射，可促进耐受原性免疫反应，有助于自身免疫性疾病的治疗[99]。
例如，在移植手术前，从供体引入的Exos会延长患者的移植接受时间[100]。另一方面，肿瘤来源的Exos表面可能存在免疫抑制分子，如(膜相关的)TGF-β1[101]或FasL，这些分子可能导致DC从骨髓前体分化受到抑制，抑制NK细胞的细胞毒性活性，抑制T淋巴细胞和促进Treg扩增，从而导致免疫系统逃避或诱导抗增殖作用[102]。此外，一些实验显示，dex介导的NK T细胞减少与Treg作用无关[103]。
所以肿瘤衍生的Exos表现出相互矛盾的免疫效应;有时它们可以减少CD4和CD8 T淋巴细胞/NK细胞的增殖或促进免疫抑制细胞如Treg或髓细胞的分化，有时来自肿瘤细胞的Exos通过增加抑制性髓细胞的分化和降低NK细胞的活性来促进肿瘤的生长和转移。其他组织和细胞分泌带有免疫抑制分子的Exos。例如，胎盘源性囊泡具有fasl介导的t细胞抑制特性或精液中的前列腺体。胎盘外植体也分泌抑制NK淋巴细胞的exo。此外，乳和初乳中存在的Exos对T细胞具有免疫抑制作用。存在于肺和肠的支气管肺泡液中的外显子，根据宿主状态的不同，可表现出耐受性特征或相反地增加气道上皮细胞的促炎细胞因子分泌[104]。
Exos在CI中的应用是基于抗原呈递细胞(antigen-presenting cell, APC)到DC的基础上发展起来的，它可以激活特异性CD4 +和CD8 + T细胞和NK细胞[81]。肿瘤来源的Exos(从肿瘤细胞中分离或用肿瘤抗原脉冲的DC)通过携带肿瘤抗原，将其传递给T细胞并引发它们，从而诱导抗肿瘤反应，从而导致肿瘤细胞死亡。这种能力表明，肿瘤来源的Exos可用于开发无细胞癌症疫苗[89]。DC-Exos在无细胞抗癌疫苗I期临床试验中表现出激活NK细胞增殖和活化的能力。这些观察结果表明，无细胞抗癌疫苗将很快问世[105]。
Exos的纯化可以使用不同的协议。最基本和最常见的方案是蔗糖密度梯度超离心，它包含多个离心和超离心步骤[106]。这种方法非常耗时，并且需要大量的生物样品。最终产品纯度高，无蛋白质污染。有时初始步骤被单个过滤步骤所取代，这样可以减少时间和成本，但问题是初始样本量大[107,108]。
第二种纯化方法使用带有捕获Exos的外泌体表面分子特异性抗体的珠粒(基于免疫亲和捕获的技术)。该方法在分离特定的外显子亚群方面效率高。然而，该方案所需的试剂价格昂贵，并且只能用于无细胞样品[108]。
第三种程序涉及超滤盒和超滤泵，可用于从大、中体积中纯化外泌体，这使其适用于纯化外泌体的临床应用[109]。虽然超滤产生高纯度的Exos，但从Exos-膜上去除粘附蛋白是复杂的，并且材料形状和电荷对超滤过程有影响[107]。
第四种方法是微流体隔离装置，通过同时进行多个步骤，减少了样本量，节省了时间[107]。因此，新方法的发展一直被考虑;例如，最近Kang等人开发了一种流线型微流控芯片，该芯片结合了微流控装置和化学释放策略，可从活的NK细胞中收集NK- exos[110]。
外显子鉴定和表征包括用电子显微镜或纳米颗粒跟踪分析(NTA)进行形态学分析、外显子纯度评估、SDS-PAGE分离、外显子蛋白染色、用连续蔗糖梯度进行物理性质分析、用免疫印迹法或酶联免疫吸附法(ELISA)进行蛋白质数量和组成分析以及流式细胞术分析[109,111]。
NK-Exos对一系列癌症具有特定的细胞毒性和抗肿瘤活性。例如，NK(92MI)-Exos对胶质母细胞瘤[112]和黑色素瘤[113]的治疗效果显示出相当大的细胞毒性活性。相比之下，NK-Exos与K562-mbIL21细胞共培养对乳腺癌和急性淋巴细胞白血病(ALL)具有抗癌活性[114]。
NK-Exos通过不同的生物活性分子发挥作用，包括治疗药物、mirna (MiRs)和细胞毒性蛋白[115]。MiRs是一个天然存在的小非编码rna家族，作为癌基因或肿瘤抑制因子[116,117,118,119]。这些生物活性分子的功能、数量和类型可以根据细胞预处理、生理状态或来源而变化。NK-Exos的细胞毒作用不涉及单个分子[115]。图4显示Paclitaxel (PTX)负载的- exos可以杀死乳腺肿瘤细胞[120,121]。此外，NK细胞释放由MiRs组成的Exos。NK-Exos中的MiR-3607-3p通过靶向IL-26阻止胰腺癌细胞的进一步侵袭。NK-Exos中的MiR-186可以下调极光A激酶(AURKA)和v-myc禽髓细胞瘤病毒致癌基因神经母细胞瘤同源物(MYCN)的表达，从而抑制神经母细胞瘤细胞的增殖并诱导细胞凋亡[122]。
图4
NK-Exos在免疫刺激(调节)、免疫抑制和细胞毒活性中的作用。NK-Exos通过不同的机制发挥作用，这取决于生物活性分子，包括治疗药物、mirna (MiRs)和携带的细胞毒性蛋白。紫杉醇(PTX)负载- exos，杀死肿瘤细胞;MiR-3607负载- exos，阻止癌细胞侵袭;MiR-186负载- exos，抑制细胞增殖和诱导;负载- exos的细胞毒蛋白通过caspase依赖性和非依赖性凋亡途径杀死癌细胞
此外，图4显示了细胞毒性蛋白通过caspase依赖性和非依赖性凋亡途径杀死癌细胞的表现。颗粒蛋白(GLN)破坏细胞膜，激活应激介导的细胞凋亡。颗粒酶B (Granzyme B, GzmB)直接诱导原aspase，阻断线粒体，释放细胞色素c，诱导细胞凋亡级联。颗粒酶A (Granzyme A, GzmA)诱导SET蛋白复合物的裂解，导致单链DNA损伤[123]。最后，NK- exos刺激免疫细胞，这又包括五种作用模式，包括刺激单核细胞上共刺激分子的表达，通过作用于单核细胞激活T细胞，通过上调CD25直接激活T细胞，刺激NK细胞，并在T细胞和单核细胞刺激下提高CD56dim NK细胞的百分比[124]。
PFN是一种成孔蛋白，允许NK-Exos中的Gzm进入宿主细胞并在核内体中产生孔，释放Gzm。NK-Exos进入宿主细胞触发caspase非依赖性和依赖性凋亡[125]。在不依赖caspase的细胞死亡中，GzmA激活线粒体应激，导致活性氧释放和DNA损伤。该蛋白还可以靶向核蛋白进行降解，使脱氧核糖核酸容易受到半胱天冬酶和核酸酶的攻击[126]。在caspase依赖性细胞死亡中，GzmB直接诱导信号级联，阻断线粒体并释放细胞色素C，触发caspase-7、-3和-9[127,128]。GLN直接损害细胞膜，引发内质网应激性细胞凋亡。据报道，在nk - exos处理的肿瘤细胞中，caspase的激活，细胞色素C的释放，SET核原癌基因和高迁移率组蛋白2 (HMG-2)的加速降解。内质网相关标志物，包括磷酸化真核起始因子(eIF2α)和r样内质网激酶的表达变化，表明内质网应激参与了上述过程[129]。因此，内质网、线粒体应激和caspase信号在nk - exos激活的细胞毒性中是至关重要的。
FasL是死亡因子的II型跨膜蛋白，激活多聚(adp -核糖)聚合酶和caspase-3和-8，触发外源性凋亡通路。这种蛋白被打包到NK-Exos中[130]。在大多数NK-Exos中已经报道了FasL跨膜蛋白的膜结合和可溶性形式[131,132]。它们通过不同的机制起作用，如内吞途径，其中由可溶性FasL蛋白组成的NK-Exos被细胞吸收，并活性FasL衍生的细胞死亡和受体-配体相互作用，这显示出对黑色素瘤的剂量和时间依赖性毒性作用[75,113]。然而，FasL在nk - exos衍生毒性中的功能仍然存在争议，大部分信息来自抗fas Ab阻断研究。例如，NK(92)-Exos对乳腺癌(MDA-MB-231/F)和黑色素瘤(B16F10)细胞具有细胞毒作用，可通过抗fas Ab清除[114,133]。相反，尽管NK-Exos含有FasL，但它们可能与NK-Exos的毒性无关。有研究表明FasL/Fas通路受到靶细胞和NK-Exos上Fas表达的影响[67]。
NK细胞通过释放Exos发挥免疫调节作用，Exos由靶向免疫系统的分子组成[134]。NK-Exos通过增加单核细胞上共刺激分子的表达，间接或直接刺激免疫细胞并诱导T细胞，从而激活T细胞增殖[135]。NK- exos也被报道诱导NK细胞，主要是CD56bright表型的NK细胞[136]。此外，NK- exos作用下的NK细胞可以改变天然细胞毒性受体(NCR)的表达。它们对神经母细胞瘤细胞具有较高的毒性[137]。
免疫抑制是癌细胞通过持续分泌Exos和可溶性因子或通过强迫ICP分子的表达来逃避免疫应答的一种作用模式[135]。NK-Exos可以调节免疫反应，甚至逆转癌症免疫抑制，使其成为CI的候选者[135]。TGF-β通过免疫细胞阻碍癌细胞的识别和清除[138]，并与脂多糖或IL-10一起作用，模拟免疫抑制环境。而TGF-β可提高NK-Exos的抗肿瘤能力[139]。此外，即使在免疫预防条件下，这些Exos也能刺激NK细胞、T细胞和单核细胞。一些报道表明，NK-Exos具有作用于TGF-β途径的物质，从而减轻免疫抑制[140141142]。NK-Exos可以降低ICP原代分子的表达，ICP原代分子在多种免疫细胞中表达，在肿瘤对CD28/ cd3诱导的T细胞的免疫逃逸中发挥关键作用[143]。此外，NK-Exos由多种与免疫应答相关的分子组成，如MHC-II、MHC-I、IL-10、TNF-α、IFN-γ等。然而，它们的功效尚未为人所知[22,14,14,14,146]。
来自特定免疫细胞(包括NK细胞)的Exos的独特特性，为TME并发症引起的几个困难提供了解决方案。它们的丰度和纳米尺寸是癌症治疗所需的，可以有效地转移到实体肿瘤并渗透到TME中[131]。NK- exos可以穿透有问题的屏障，如血肿瘤和血脑屏障(BBB)，这些屏障对NK细胞来说是相对难以穿透的[147]。除了NK细胞渗透到包括实体瘤在内的癌症中，它们的Exos还受到TME细胞因子的强烈影响，TME偶尔会损害NK细胞的活性[137,148]。Exos的细胞间可转移性提供了与周围细胞交流或刺激其他TME活性的机会，从而导致细胞毒性作用[149]。NK-Exos对各种癌症的抗肿瘤性能表明该策略对CI具有显著的潜力。表2总结了NK-Exos治疗CI的靶向抗体(标记物)结果。迄今为止，一些研究主要关注NK-Exos在临床实践中的应用[150]。
表2 NK-Exos在靶向抗体(标记物)及特征CI中的应用
Zhu等在体内和体外研究了NK-Exos对胶质母细胞瘤、乳腺癌、间变性甲状腺癌、肝癌等四种肿瘤的抗肿瘤作用。nk - exo处理的胶质母细胞瘤异种移植小鼠通过降低细胞活力标志物(p-AKT和p-ERK)和诱导促凋亡蛋白具有较高的抗肿瘤活性。他们还发现NK-Exos显著抑制胶质母细胞瘤(U87/MG)癌细胞的生长和增殖[112]。为此，Shojae-Hassani等人表征并追踪了NK-Exos细胞在孵育后对肿瘤细胞的作用，以克服恶性细胞对免疫应答的抵抗。NK-Exos暴露于神经母细胞瘤细胞后，可激活原始NKs群体的Exos，对靶细胞产生更严重的细胞毒性作用[137]。
此外，Zhu等人证实NK- exos表达的两种NK细胞重要蛋白FasL和PFN在体内通过过表达TNF-α对抗侵袭性黑色素瘤影响肿瘤细胞增殖的信号通路。NK (92MI)-Exos特异表达NK细胞的FasL和PFN两种功能蛋白;此外，它还分泌TNF-α，影响细胞增殖的信号通路[113]。因此，Federici等人指出NK-Exos诱导T细胞上CD25的表达，单核细胞上共刺激分子的表达，人白细胞抗原DR (HLA-DR)在黑色素瘤患者血液中的外周血单核细胞(PBMC)中表现出刺激功能。NK- exos增强了CD56+ NK细胞的细胞比例，这表明NK- exos调节的效应可能是支持CI的特异性。他们的研究结果还记录了PBMC中较低水平的TSG101+CD56+ Exos和NK细胞，强调了免疫酶测试检测NK细胞介导的免疫系统改变的能力[135]。
Lee等人通过实验证明犬NK-Exos可以表达Granzyme B、Perforin 1、TSG101、HSP70、Alix、CD81和CD63等特异性标记。探讨NK-Exos对小鼠乳腺肿瘤的抗肿瘤作用。他们观察到肿瘤大小减小，凋亡标志物如Bcl-xL和Bax以及肿瘤发生相关标志物如PCNA、p53、MDR、TNF-α、IL-1β、MMP-3、VEGF和Bmi-1下降。因此，他们认为犬NK-Exos是一种有效的乳腺癌治疗剂[137,151]。Dosil等人发现NK-Exos microrna，如miR-155-5p、miR-92a-3p和miR-10b-5p，可以靶向负责Th1应答的特定分子。NK-Exos下调GATA-3在CD4+ T细胞中的转录。它们导致Th1的极化和IL-2和IFN-γ的积累。NK-Exos microrna部分概括了NK-EV在体内的影响。这一观察结果为NK-Exos的免疫调节作用提供了新的见解，有助于提高其作为癌症免疫治疗工具的应用[122,137]。Nie等观察到NK-Exos不仅可以直接诱导肿瘤凋亡，还可以通过多种途径促进细胞毒性T淋巴细胞的作用，包括肿瘤相关巨噬细胞的重编程和肿瘤细胞中MHC-I的上调。因此，作者认为NK-Exos可以通过免疫调节功能显著增强对实体瘤的过继t细胞治疗[137,152]。
为了评估NK-Exos在白血病中的作用，我们研究了一组血液学肿瘤在BM上导致的血细胞异常。在一项努力中，Boyiadzis等人在两项研究中提出，基于nk - exos的白血病靶点细胞毒性为白血病患者提供了一种新的治疗方法。本研究利用NK- exos携带PD-1、KIR、TGF-β、GzmB、PFN、天然细胞毒性受体、NK细胞受体NKG2D，并测定使用NK- exos的剂量。NK-Exos通过增加剂量(10-70μg)介导对原发性白血病母细胞、急性髓性白血病(AML)和K562细胞系的抗白血病活性[149]。值得注意的是，高剂量的NK-Exos记录了更高水平的细胞毒性，这表明exos调节的裂解以浓度依赖的方式控制[153]。
NK-Exos在CI稳态和免疫监测中的潜力令人鼓舞，可能成为最有效的癌症疫苗和药物/抗原载体。因此，了解NK-Exos如何作为抑制癌症进展的新参与者用于免疫治疗。在一项研究中，Lugini等人证明，从健康供体血浆中纯化的Exos可以表达NK细胞标记物，如PFN和CD56+，并对各种活化的免疫细胞和癌细胞具有细胞毒活性。他们认为NK-Exos在体内平衡和免疫监视中起着至关重要的作用[154]。
此外，Di Pace等人对细胞因子培养的NK细胞的外显子进行了评估，揭示了基于外显子的免疫治疗人类癌症的机制。IL-15和IL-2诱导的Exos水平相当，货物成分相似。对暴露在Exos表面或包含在Exos中的分子的分析允许识别在NK细胞功能中起重要作用的分子，如PD-1, DNAX辅助分子-1 (DNAM1)， LFA-1和IFN-γ。根据观察，DNAM1负责外显子介导的毒性，其延迟宿主细胞凋亡。NK-Exos可以扩散到组织中，在肿瘤部位发挥催化作用。这为将NK-Exos与癌症治疗相结合提供了线索[111]。Wu等人还监测了NK-Exos中细胞毒性蛋白的水平，包括FasL (2.5 ng/mL)、颗粒蛋白(GNLY, 56 ng/mL)、GzmB (23.4 ng/mL)、GzmA (185 ng/mL)和PFN (550 ng/mL)。细胞毒性与细胞毒性蛋白水平之间的关系表明，GNLY、GzmB、GzmA和PFN均与毒性呈正相关，这表明没有单一的毒性蛋白主要负责杀伤，所有这些蛋白都可能与毒性有关。在NK-Exos处理的细胞中，GzmA底物HMG2和SET减少，表明该蛋白可能激活不依赖于caspase的死亡途径。此外，caspase依赖性死亡途径的主要标志物细胞色素C也从线粒体中释放出来。作者指出，NK-Exos可诱导多种杀伤机制，包括caspase依赖性/非依赖性细胞死亡途径，可调节对肿瘤细胞的毒性[129]。
Li等人也提出了含有mir - NK-Exos减轻小鼠慢性轻度应激迹象的证据。在体内，评估显示这些NK-Exos降低了星形胶质细胞释放的促炎细胞因子IL-6、TNF-α和IL-1β的水平。MiR-207通过富亮氨酸重复序列直接靶向TLR4相互作用因子，抑制星形胶质细胞中NF-κB信号传导，降低抗抑郁活性。因此，作者认为含有mir -207的NK-Exos可以通过靶向富含亮氨酸的重复序列来抑制星形胶质细胞中的NF-κB信号传导来缓解小鼠的抑郁症状[155]。
Wang等人报道了一种名为鸡尾酒疗法的新策略，将仿生核壳纳米颗粒(csnp)与NK-Exos结合使用。通过FasL/Fas和内吞作用的csnp / NK-Exos混合物是将MiR传递到神经母细胞瘤细胞的高效载体[145]。因此，Han等研究表明，PTX包封NK-Exos (PTX-NK-Exos)处理MCF-7(乳腺)肿瘤细胞的迁移率和凋亡率分别显著降低和增加[21]。最近，Tae Kang等人利用nk -石墨烯氧化物(GO)微流控芯片方法从非小细胞肺癌(NSCLC)患者血液中分离出NK-Exos。这种新的分离方法为研究对循环肿瘤细胞具有高细胞毒功能的NK-Exos提供了新的视角[110]。此外，Jiang等人在另一项研究中评估了NK (92)-Exos与缺氧NK (92- hil -15)-Exos和NK (92)-Exos的功能，显著增加了NK细胞GzmB、PFN、FasL等有效蛋白含量。他们认为NK-Exos细胞的缺氧治疗可能是癌症治疗的一种有用的治疗选择[14]。
在一项研究中，Kaban等人评估了一种基于NK-Exos靶向乳腺癌细胞系Bcl-2基因剂量的新策略。他们的研究结果表明，携带抗Bcl-2 sirna的NK-Exos可显著降低Bcl-2的表达并诱导细胞凋亡。[156]。Neviani等人报道，携带肿瘤抑制因子MiR-186的NK-Exos对mycn扩增的神经母细胞瘤细胞系具有高细胞毒性。他们的数据显示，MiR-186在神经母细胞瘤患者中的表达显著降低。他们还发现MiR-186的表达与TGF- β2、TGF-β1、AURKA和MYCN基因的表达呈负相关，这些基因在神经母细胞瘤细胞的进展中起着至关重要的作用。靶向递送MiR-186到神经母细胞瘤细胞可以显著抑制神经母细胞瘤细胞的进展。它可以作为与NK细胞免疫疗法联合的补充疗法[139]。因此，Sun等人在与NK细胞同时培养的胰腺肿瘤细胞中检测了癌细胞的迁移、血管生成和增殖能力。生物素- rna下拉实验和报告基因实验数据显示，nk - exos负载的miR-3607-3p能够靶向胰腺TME中表达的IL-26，在体内和体外抑制胰腺肿瘤细胞的生长发育。他们认为这些exo可能是治疗各种癌症的合适方法[147]。
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