肝片形吸虫病(Fasciola hepatca)和多布尼甲状吸虫病(Calicophoron daubneyi)是两种重要的家畜传染病。杜氏Calicophoron daubneyi是欧洲主要副胃虫种，近10 ~ 15年呈上升趋势。在意大利，有证据表明，南部反刍动物中肝梭菌的流行率较低，但最近在同一地区报告了多布内梭菌的高流行率。考虑到可靠的工具对反刍动物肝脏和瘤胃吸虫诊断的重要性，本研究评估了Mini-FLOTAC (MF)、Flukefinder(R) (FF)和沉淀法(SED)技术在使用加钉和自然感染的牛粪便样本检测和定量肝F.和C. daubneyi卵方面的诊断性能。

　　简单地说，阴性的牛粪便样本被人为地添加了肝梭菌或多布尼梭菌的鸡蛋，以达到不同的鸡蛋计数水平:每克粪便(EPG) 10、50和100个鸡蛋。此外，还选择了意大利南部10个被肝型梭菌和/或多布尼梭菌自然感染的牛场。对于每个养殖场，仅使用MF技术单独分析样本，并使用MF、FF和SED技术作为池进行分析。采用贝叶斯潜类分析(LCA)对自然感染猪场感染强度和感染率预测的敏感性和准确性进行评估。

　　本研究结果表明，在50和100 EPG的加标感染样品中，MF的虫卵回收率最高，其次是FF和SED，而在10 EPG的较低感染水平下，FF的虫卵回收率最高。此外，在感染水平> 20 EPG时，研究中包括的所有技术对肝梭菌和多布尼梭菌卵的敏感性估计为> 90%。然而，MF是评估的三种技术中最准确的估计吸虫感染强度。然而，这三种技术都有可能准确地估计农场水平的感染率。

　　为了提高吸虫卵的FEC，需要对技术进行优化和标准化。

　　

　　淡水蜗牛传播的寄生蠕虫中，肝片吸虫(肝吸虫)和瘤胃吸虫(瘤胃吸虫)广泛分布于温带国家。片形吸虫病主要在西欧高度流行[1,2,3,4]，对全球畜牧业造成的重大生产损失每年超过30亿美元[5]。

　　旁胃病被认为是欧洲反刍动物中一种新出现的寄生虫病[6]。在过去的20年里，其发病率和流行率在欧洲显著增加，不同国家报告了许多临床表现的暴发，主要是由欧洲主要的副虫科物种C. daubneyi引起的[7,8,9,10,11]。临床上的胃旁口病多是由被感染宿主小肠内大量的幼年吸虫引起的，而成虫一般位于瘤胃和网状，耐受性较好[12]。

　　在意大利，反刍动物中肝螺旋体的流行率似乎很低(绵羊为0.7-6.0%，牛为0.9-7.8%);然而，最近有报道称，在同一地区，多布内梭菌的流行率很高(绵羊为4.5-51.1%，牛为9.6-60.9%)[13,14,15]。

　　诊断对于实施最有效的筋膜吸虫病和胃旁口病控制方案非常重要[16]。

　　Hoyle等人进行的一项调查结果[17]揭示了羊和/或牛养殖者对吸虫的诊断和控制的困惑，强调了提供最佳实践建议的必要性。反刍动物筋膜虫病和胃旁口病的诊断和监测具有挑战性。通常，农场的肝吸虫存在信息来自肝脏谴责报告[18]，这是基于对屠宰场的目视检查，但这些程序是可变的，并且可能是错误的，因为它们没有标准化[19]。存在几种死前诊断吸虫的检测方法，但没有一种被认为具有足够的灵敏度和特异性，可作为“栏侧检测”在现场使用[20]。基于协原抗原的技术是很有前途的诊断工具;它们对检测实验性羊片形虫病表现出100%的敏感性，并提供了吸虫负担与粪原抗原数量之间的相关性信息[21]。然而，基于elisa的技术不能直接在农场使用，也没有在现场条件下进行广泛验证，以确认在实验感染中获得的敏感性[22]。

　　相反，吸虫粪卵计数(flukeFECs)简单而快速[19]，也可以直接在农场进行，因为既不需要专业的采样技术，也不需要复杂的实验室设备。FlukeFECs通常用于兽医寄生虫诊断，几乎具有100%的特异性，尽管它们只能检测到专利感染[20]。目前尚无吸虫感染的金标准诊断工具，因此通常结合临床症状、放牧史、血清学、粪原抗原和吸虫感染和/或屠宰场报告来确认吸虫感染。flukeFECs的几种变体已经开发出来，包括简单沉降(SED)[23]、沉降与浮选结合[23]、沉降与精细过滤[24]、Flukefinder?技术(FF)[25]或浮选与(Mini-) FLOTAC技术[1,26]。考虑到可靠的工具对反刍动物肝脏和瘤胃吸虫诊断的重要性，本研究旨在评估MF、FF和SED技术在使用加钉和自然感染的牛粪便样本检测和定量肝F.和C. daubneyi卵的诊断性能。

　　阴性的牛粪便样本被人为地加入肝梭菌或多布尼梭菌卵，以达到每克粪便(EPG) 10、50或100个卵的不同卵数水平。从位于意大利南部坎帕尼亚地区的三个农场的成年牛(> 24月龄)粪便中采集了肝梭菌和多伯尼梭菌阳性和阴性样本。被两种吸虫之一自然感染的阳性样本从放牧的牛中采集，而阴性样本从没有牧场的圈养奶牛中采集。

　　为了鉴定可能用于取卵的阳性样本，以及需要进行实验感染的阴性样本，采用FLOTAC基本技术(灵敏度为94%，特异性为98%)分5个重复对每个样本进行分析，使用硫酸锌浮选溶液(比重力为1.35)对粪便进行检测限为1 EPG[14,27]。采用Bosco等人[28]描述的卵子回收技术，对阳性牛作为供体，从粪便中提取肝梭菌和多布尼梭菌卵子，并进行了一些修改。采用1 mm、250 μm、212 μm和63 μm 4种不同网目的筛子对粪中吸虫卵进行分离。用自来水洗涤63 μm筛网回收鸡蛋，在锥形烧杯中沉淀4 min，去除上清，得到的沉淀物为纯化的鸡蛋悬浮液。对两种吸虫分别采用提取方法，获得单感染样本。将每个吸虫获得的纯化卵悬浮于蒸馏水中，以10个等分(每个10 μl)计算卵数的算术平均值来测定其浓度。制备3种浓度分别为10、50和100 EPG的卵悬液，分别加入适量的卵悬液至3份阴性粪便样本(不含蠕虫)中并均质。使用三种方法(MF、FF和SED)分析每个样品的6个重复(图1)。

　　图1

　　

　　使用Mini-FLOTAC (MF)、Flukefinder (FF)和沉淀法(SED)技术检测和定量肝片形吸虫和多布尼加利孔虫卵，分析加卵和自然感染(单独或合并)粪便样本的数量

　　选择了意大利南部10个牛群中有吸虫阳性(感染杜布尼梭菌和/或肝梭菌)的农场。这些养殖场是根据寄生虫感染监测区域中心(意大利南部坎帕尼亚地区CREMOPAR)的诊断活动确定的。

　　在每个农场，直接从20头成年牛(> 12个月)的直肠中收集粪便样本。对于每个养殖场，样品仅使用MF技术单独分析，并作为池使用FF和SED技术进行分析。采用Rinaldi等人[29]描述的方案对4个粪便池(每池5个样本)进行处理(图1)。

　　按照制造商的说明，对加标样品和自然感染样品进行三种共显微方法。粪卵计数(FECs);在EPG中表达的)，使用5倍乘法获得MF(检查0.2 g粪便=2 ml粪便悬浮液，其中总容积为50 ml中含有5 g)， 0.5倍乘法获得FF(检查2 g粪便)，0.1倍乘法获得SED(检查10 g粪便)(表1)。

　　表1 Mini-FLOTAC (MF)， Flukefinder的基本特征(R)(FF)和沉降(SED)技术包括在研究中

　　从加了鸡蛋的粪便样本中估计了这三种技术的敏感性以及预测感染强度的准确性。首先，计算吸虫卵的回收率，以评估每种技术在每个卵数水平下FEC的准确性，使用以下公式:%卵回收率=100 -(真实FEC -观察FEC)/真实FEC × 100[28]。此外，开发了一个简单的模型来估计使用不同技术计数的卵的过度分散，假设测量误差根据负二项分布(如Prada等人[30])，这是一个比使用泊松假设更灵活的假设，如Atljia等人[31]。由于三种技术所检测的粪便样本的大小(以克为单位)不同，EPG中的剂量需要转换为粪便样本中预期的鸡蛋数量(表1)。该模型在贝叶斯框架下运行，使用R[32]、“jags”[33]和“runjags”[34]中的吉布斯采样包，其中burn in为1000(丢弃运行)，共抽取10,000个样本，稀释10个。

　　初步模拟(未显示)表明，两种寄生虫的过度分散是相同的;因此，每个诊断技术使用一个参数。使用从上述模型获得的过分散的后验分布，我们模拟了三种诊断方法在EPG测量的真实感染强度范围内的1000次重复测量，从1到100(在0.5 EPG步骤，总共199,000个样本)。然后，我们通过比较真实感染强度与通过不同诊断方法估计的感染强度，计算敏感性(正确识别为阳性的样本比例)和估计感染强度的准确性。

　　为了估计自然感染农场的感染率，我们根据最近对其他寄生虫的研究，开发了贝叶斯潜类分析(LCA)模型[30]。根据不同的诊断(包括个体水平的MF及其对汇总样本的贡献)估计每只动物的感染状况。每个受感染个体的感染强度(真卵数)将从伽马分布中得出。利用该模型估计了C. daubneyi的伽马分布参数;而对于肝f.s cara，由于阳性样本数较少，无法从这些数据中进行估计，因此根据Rinaldi等[1]报道的数据进行计算。每个池中的卵数被假设为该池中五个个体的真实卵数的平均值。来自不同诊断的数据假定是由(个体或池中)卵子真实数量的负二项图生成的。所需的过分散值是由上述模型对加了鸡蛋的粪便样本产生的后验分布得出的。然后可以估计农场水平的感染率，并可以模拟未在个体水平收集的FF和SED的预期农场感染率。和以前一样，我们使用“jags”[33]和“runjags”[34]包来运行模型;我们再次丢弃了1000次运行(burn in)，总共绘制了10,000个样本，没有细化。所有代码可在https://github.com/joaquinprada/Fluke-MF-FF-SED-Comparison上获得。

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　　表2报告了在不同已知EPG浓度(10,50,100)下，用加了鸡蛋的牛粪便样本检测肝梭菌和多伯尼梭菌EPG水平的结果。结果表示为6个重复的平均EPG，比较研究中3种不同技术(MF、FF和SED)的性能。刺卵试验显示，所有方法都能从牛粪便中回收肝f.a和多布尼衣杆菌的卵，其中MF在15 EPG以下的敏感性最低，SED在15 EPG以上的敏感性最低(图2)。然而，在20 EPG以上的感染水平下，所有三种技术的敏感性都> 90%。此外，当比较不同诊断方法的真实感染强度和估计感染强度(EPG)时，MF技术在准确性(估计EPG的中位数)和精度(95%可信区间的大小)方面提供了更好的估计(图3)。

　　表2 .的平均检测次数及回收率肝片吸虫 (跳频),Calicophoron daubneyi (CD用Mini-FLOTAC (MF)和Flukefinder处理的带刺感染牛粪便样本，检测不同卵数水平的鸡蛋(R)(FF)和沉降(SED)技术包括在研究中

　　图2

　　

　　估计三种诊断技术，Mini-FLOTAC (MF)， Flukefinder(R) (FF)和沉淀法(SED)，在感染强度范围内的敏感性，以每克粪便(EPG)的鸡蛋来衡量

　　图3

　　

　　每克粪便中卵的真实感染强度与估计感染强度的比较。黑色斜线虚线表示真实epg和估计epg相等的位置。估计感染强度的中位数用实线表示，而阴影区域表示95%可信区间，包括Mini-FLOTAC (MF)， Flukefinder(R) (FF)和沉淀法(SED)三种诊断技术。

　　在评估意大利南部10个农场的自然感染情况时，虽然所有农场都以高感染率感染了C. daubneyi，但有4个农场似乎对F.肝炎呈阴性或感染率较低(图4)。总体而言，个人水平MF技术估计的感染率与模型估计的感染率非常相似，尽管在感染率较低时可能低估了感染率(图4左侧)。模拟个体水平的FF和SED诊断结果也产生了所有农场中两种寄生虫的可比感染率值(图4 -暗红色和深绿色)。与SED相比，MF和FF混合样本的平均epg更高(表3)。

　　图4

　　

　　意大利南部十个农场的肝片形吸虫(左)和多布尼卡利虫(右)感染率。Mini-FLOTAC的感染率是根据个人水平的样本(紫色)计算的，而Flukefinder(R)(暗红色)和沉降(深绿色)的中位感染率是根据模拟的个人水平数据估计的。模型估计，考虑到所有三种诊断技术，以及个人水平和汇总样本，用黑色表示。误差条表示95%可信区间

　　表3粪便中每克卵数(EPG)肝片吸虫 (跳频),Calicophoron daubneyi (CD)，使用来自10个农场的自然感染牛粪便样本进行单独分析。每个农场20个样本仅使用Mini-FLOTAC (MF)技术和汇集的粪便样本(没有。每个农场有4个水池样本)，使用了研究中包括的Flukefinder (FF)和沉淀法(SED)技术

　　在这项研究中，据我们所知，MF首次与FF和SED进行了比较，用于检测加药和自然感染的牛粪便样本中的肝脏和瘤胃吸虫。Malrait等[26]已经成功地将MF用于评估瘤胃吸虫感染的存在和测定杜氏C.卵的FEC，结果表明MF是一种可靠的方法，灵敏度和特异性分别为94%和98%。在我们的研究中，在50和100 EPG的加标感染样品中，MF技术可以回收最多的卵，其次是FF和SED，而10 EPG的较低感染水平的FF获得了最好的结果。上述发现在两种吸虫中是相似的。特别是，100 EPG时的MF回收率最高，但肝吸虫和瘤胃吸虫的回收率分别为64.2%和70.8%，低于Amadesi等人先前对牛胃肠道线虫(GIN)的研究报告(98.1%)[35];Paras等[36]70.9%)、绵羊(Bosco等[28]和Godber等[37]100%)和马(Napravnikova等[38]74.2%)，但高于Noel等[39]报道的马圆形卵(42.6%)。这种差异可以用以下事实来解释:吸虫的蛋很重，而反刍动物和马的蛋很轻;因此，在浮选溶液中的行为和回收率是完全不同的[27,28,35,40]。然而，SED是效率最低的技术，卵子回收率较低。我们的研究结果与之前的FF技术和SED技术的比较一致，FF技术比简单的贝克尔沉淀法更有效地回收羊和牛粪便中的肝螺旋体虫卵;事实上，在低感染水平下，它能够以更高的灵敏度(100%)检测到2 EPG[19]。虽然沉淀法(即简单、细过滤、浮选)是检测吸虫感染最常用的方法，但其灵敏度较低[16,19]。当感染强度> 20 EPG时，研究中所有技术的估计灵敏度都> 90%(图2)。然而，在非常低的感染强度下，估计灵敏度下降，特别是MF，其检测限为5 EPG。用MF获得的结果与Zarate-Rendon等人的研究结果一致[41]，表明MF和FF对人肝梭菌FEC的检测结果优于Kato-Katz，在96 EPG水平下灵敏度为100%，但在14 EPG水平下，MF和FF的灵敏度分别下降到40%和60%。在我们之前的研究中，比较了MF和FLOTAC对吸虫卵的检测，结果表明，在低感染水平下，FLOTAC比MF具有更高的敏感性。FLOTAC技术中的离心步骤有助于增加吸虫卵的检测数量，而这是MF方法所缺少的[40,42]。

　　另一方面，MF是三种估计感染强度的技术中最准确的，这与之前在反刍动物和马中进行的GIN研究一致[28,35,43]。然而，FF和SED更可能高估或低估感染强度，这些结果在整个感染强度评估范围内(从1到100 EPG)是一致的。在其他研究中[35,44,45]，随着粪便样本中EPG的增加，准确性提高。然而，在低感染水平下使用低检测限和高精度的诊断工具是非常重要的，因为只有少数吸虫的存在(特别是对这种寄生虫高度敏感的肝螺旋体和羊)会导致生产力显著降低[46,47]。

　　从自然感染的牛身上获得的MF结果表明，在对所有10个农场进行的两种吸虫分析中，单个样本和汇总样本没有统计学上的差异，正如之前在反刍动物中的GINs中所显示的那样[29,42,48,49,50]。此外，该模型估计的流行率(包括三种技术之间的信息)与MF测量的感染率以及模拟FF和SED技术估计的感染率一致。所有养殖场均存在多伯尼梭菌，且感染率非常高，而大多数养殖场中存在肝梭菌，其中4个养殖场没有回收阳性样本，这表明没有感染(或感染率相对较低)。由于检测到的肝芽胞杆菌卵数量较少，由于无法评估该地区的感染强度，需要进行进一步的研究。

　　为了提高吸虫卵的FEC，需要对技术进行优化和标准化。灵敏、准确、精密和标准化的FEC技术与可靠的自动化系统相结合，不仅可以进行有效的观察，而且由于使用了人工智能软件，还可以对寄生元素进行量化[51,52]。MF是一种准确估计中等至高度感染强度的技术，可在流行地区推荐使用，例如用于诊断意大利南部的多布尼衣原体。

　　最后，进一步的研究对于支持明智的治疗决策以及确定“经济相关”感染水平的阈值以及评估围绕该阈值的不同测试的诊断性能可能很重要。

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