随着包括重金属在内的有毒化合物的暴露增加，不孕症变得越来越普遍。卵泡液(FF)包围着卵巢中发育中的卵母细胞，可用于分析评估金属含量。在一个生殖单元中测量了93名女性FF中的22种金属含量，并检查了它们对辅助生殖技术(ART)的影响。用光学发射分光光度法测定金属。低铜、低锌、低铝、低钙有利于多囊卵巢综合征。卵母细胞数量与金属元素的关系:铁(rs=0.303;P=0.003)和钙(rs=- 0.276;P=0.007)，成熟卵母细胞数量与铁(rs=0.319;P=0.002)，钙(rs=- 0.307;P=0.003)和钠(rs=- 0.215;P=0.039)，并且在铝的情况下接近显著性(rs=- 0.198;p=0.057)。在受精率≤75%的组中，36%的妇女钙含量>176.62 mg/kg，而受精率≥75%的组中这一比例仅为10% (p=0.011)。过量的铁和钙会降低优质胚胎的比例，而过量的钾会损害囊胚的比例。如果钾高于237.18 mg/kg，钙低于147.32 mg/kg，这些条件有利于胚胎着床。妊娠受高钾低铜的影响。建议对生育能力下降或接受抗逆转录病毒治疗的所有夫妇控制接触有毒元素。
目前生育率正在下降，越来越多的夫妇受到生殖障碍的影响[1]。其中一个可能的原因是有毒金属环境污染导致一些毒素如重金属(HM)的负面影响被检测出来[2]。它们在生殖组织中的积累证实了其生殖毒性的可能性[3]，并且在女性中观察到最严重的后果，因为卵巢中的生殖细胞数量在胎儿期是固定的，不可再生[4]，并且随着时间的推移而减少。
HM毒性的主要机制有:通过脂质膜崩解产生自由基，引起机体细胞氧化应激[5];酶、蛋白质、脂质、核酸等生物分子损伤及对DNA的损伤[6]。有毒金属暴露使人体内活性氧(ROS)含量增加，最终诱发一系列氧化损伤过程[7]，扰乱抗氧化防御系统，从而促进OS、坏死和细胞凋亡[8]。HM可与雌激素受体结合，干扰激素信号通路，导致性激素紊乱[9]。
金属暴露与卵母细胞成熟[5]、排卵和受精[10]有关，因此会影响辅助生殖治疗(ART)[2]。如果卵母细胞在干扰原始卵泡的有毒环境中发育，胚胎的成熟和质量就会受到损害，这可能是HMs的影响之一[5,11]。
Bloom等人[12]发现高剂量和专业接触汞、镉和铅会降低生育能力，Ingle等人[13]观察到卵泡液(FF)中Cr的存在与恢复的成熟卵母细胞数量呈负相关，Zn与受精率(FR)呈负相关。当在尿液中进行这些测定时，发现Co、Cr、Cu、Mn和Mo的水平越高，每个妇女恢复的卵母细胞越多。
其他作者报道较高的HM浓度与低质量的卵母细胞和胚胎有关[14]，相反，观察到血清和FF中较高的Zn水平可能对ART有积极作用[15]。虽然它们的机制和浓度尚不清楚，但血液中的Pb和FF中的Cu似乎对ART周期的结果有显著影响，但需要在更大的队列和不同患者群体中进行进一步的研究，以确定它们对卵母细胞质量、胚胎发育和人类生殖的影响[3]。
因此，卵母细胞的质量不仅受到细胞核和线粒体基因组的影响，还受到卵巢和排卵前卵泡提供的微环境的影响，这些微环境会影响转录和翻译，从而影响细胞质成熟度[16]。卵母细胞浸没在卵泡内的FF中，是卵母细胞第一次接触环境污染物[17]。人FF是由超滤血浆渗出物、颗粒和卵泡细胞分泌物组成。由于卵巢血管不穿透卵泡基底层，FF直接提供了颗粒细胞和卵母细胞的微环境。血液中的营养物质和外源性化合物可通过基底膜进入卵泡腔[18]。
因此，本研究旨在从受精率、胚胎质量、着床和妊娠率等方面研究FF中22种金属的存在与ART结果之间的关系。
在2019年2月至2020年12月期间，对93名在加那利大学医院生殖部门寻求抗逆转录病毒治疗的妇女进行了一项前瞻性研究，她们在FF接受了金属检测程序。
所有受试者同意参加研究，并签署了一份书面知情同意书。这项研究得到了加那利医院大学伦理委员会的批准。不。Chuc 2018 53)。先前已经详细描述了参与者招募和临床程序[19]。
参加者的就业类别如下:健康15%(护理助理、护理人员、护士、美容师、药剂师、按摩师、医生和社会工作者)，行政31%(律师、办公室工作人员、工料测量师、银行员工、会计师、平面设计师、女商人、公务员、房地产经纪人、教师和秘书)，农业3%(领班和包装人员)，运输和零售28%(机场员工、空乘人员、商店和超市助理)，酒店业19%(女服务员、客房服务员、厨师、女服务员)。清洁人员、接待员和餐厅工作人员)，其他4%(失业者和学生)。
参与者进行了卵巢卵泡穿刺和抽吸，以提取卵母细胞，评估卵母细胞的存在并分析FF中的金属。
采用控制性卵巢刺激法(COS)恢复卵母细胞。使用以下拮抗剂方案:在周期的第2天开始使用重组促性腺激素进行药理学刺激，同时给予225-300 IU的可变剂量的rFSH(法国Organon公司的Puregon?或法国默克雪兰诺公司的Gonal-F?)，与100-150 IU的尿促性腺激素HMG(绝经?)相关或不相关。一旦主卵泡直径达到14mm，每天皮下添加GnRh拮抗剂，开始时使用0.25 mg ganirelix或cetrorelix (ganirelix, Orgalutran?，Organon, France;Cetrorelix, Cetrotide?，Serono，法国)。当卵泡至少为17 mm时，在预先填充的笔中使用rHCG (Ovitrelle?250微克注射溶液，绒毛膜促性腺激素α(默克雪兰诺，巴里，意大利)进行最终成熟。
给药36 h后进行取卵(OPU)，超声视觉下经阴道针取卵。FF在处理过程中从卵母细胞中分离出来，在ART过程中被常规收集和丢弃，但可以保留用于分析。
每个患者的几个卵泡的FF，无论大小，汇集并保存在冰箱里，直到金属测定。卵母细胞被取出后，在OPU当天收集精液样本，随后处理用于ART程序。在受精和随后的胚胎分裂之前，根据适应症通过体外受精或ICSI技术对卵母细胞进行人工授精。
受精率(FR)在授精后18小时进行评估，定义为受精卵母细胞与成熟卵母细胞数量的百分比，前提是至少有一个成熟卵母细胞(MII)。
胚胎分裂率(CR)是指至少有一个受精胚胎的分裂胚胎数与受精胚胎的比例。胚胎组CR的预后为100%。良好的胚胎质量(GEQ)是根据ASEBIR(生殖生物学研究协会)的ART周期参数建立的。分裂第3天胚胎质量等级为A级和B级的为优质胚胎[20]。当GEQ值大于总胚胎队列的66.6%时，认为一个周期预后良好。
获得的囊胚率(BR)也被认为是衡量周期质量程度的一个指标。在所有周期中，有61个周期至少有一个培养胚胎，直到第5-6天，当至少50%的培养胚胎达到囊胚期时，该周期被认为预后良好。
胚胎着床率(IR)被定义为胚胎移植到子宫导致怀孕的百分比。妊娠率(PR)定义为胚胎移植(ET)周期数中至少有一个妊娠囊的周期数;共55例患者进行了106例新鲜胚胎移植，36例患者进行了66例冷冻胚胎移植。
根据ART治疗结果将研究组分为两组。对诊断为多囊卵巢综合征的患者给予特别关注。本研究的主要目的是实现妊娠和活产，次要目的是获得FR、CR、PR和GEQ。
样品处理工作在拉古纳大学毒理学系和法律和法医研究所进行。93份样品采用微波消解法(Multiwave Go, Antonpaar)分三次处理。每个反应器中分别加入1 mL样品、2 mL 30% H2O2 (Honeywell, Fluka)和4 mL 65% HNO3 (Honeywell, Fluka)，然后进行消化过程。该过程持续1和26分钟，最高温度达到180°C(图1)。消化后，反应器内容物用蒸馏水(milliq Gradient A10, Millipore, MA, USA)配制至10 ml进行分析。
图1
消化的过程。图形温度(°C) vs时间(hh:mm)
表1各水平卵泡液me的检测限(LOD)和定量限(LOQ)塔尔
与拉古纳大学毒理学系合作的加那利保健服务处以及法律和法医研究所进行了金属探测。FF中测量了以下金属:铝(Al)、硼(B)、钡(Ba)、钙(Ca)、镉(Cd)、钴(Co)、铬(Cr)、铜(Cu)、铁(Fe)、钾(K)、锂(Li)、镁(Mg)、锰(Mn)、钼(Mo)、钠(Na)、镍(Ni)、铅(Pb)、硅(Si)、锡(Sn)、锶(Sr)、钒(V)和锌(Zn)。
样品分析使用电感耦合等离子体光学发射光谱仪(ICP-OES)，型号ICP-OES Thermo Scientific iCAP PRO (Waltham, MA, USA)带自动进样器。根据仪器的响应估计仪器的检出限和定量限。具体来说，它们是通过在可重复条件下分析15个空白来确定的[21]。各水平FF金属的检出限和定量限见表1。
数据汇总为分类变量的相对频率、正态分布变量的平均值±标准差和中位数(四分位数间距IQR, P25;P75)为非正态数据。根据变量类型和待比较组数，采用Pearson卡方检验、Kruskal-Wallis检验或Mann Whitney U检验和ANOVA或t-student进行比较。根据连续变量的分布，使用Pearson或Spearman相关系数计算连续变量之间的关系程度。应用受试者工作特征(ROC)曲线，根据约登指数(Youden index)标准确定金属含量的分界点或阈值，以区分不同繁殖阶段的成功与否。随后，使用Wald 's后向变量选择方法进行逻辑回归，以模拟精子图变量和金属含量在不同阶段的成功。包括ROC曲线和曲线下面积(AUROC)。采用一种包含随机截距和随机斜率的二元logistic分布和logit链接的广义线性混合模型，考虑不同干预次数的夫妇胚胎着床问题。变量的选择使用逆向程序(p-out=0.10)，以防止可能的多重共线性效应。给出了赤池信息标准(Akaike information criterion, AICc)的值和一致性百分比。采用SPSS V 25 (IBM SPSS Statistics)和MedCalc V 19.5 (MedCalc Software Ltd.)。p≤0.05为显著性。
摘要。
介绍
材料与方法
结果
讨论
结论
数据可用性
参考文献。
致谢。
作者信息
道德声明
补充信息
# # # # #
参与者年龄在20到42岁之间，他们都住在西班牙的加那利群岛。患者平均年龄36.0±3.9岁，体重指数(BMI) 24.7±3.3 kg/m2。
在参与者中，80.4%为原发性不孕症，3.2%为继发性不孕症，8.7%报告有过流产史。另有5.4%以没有伴侣的女性身份出席，2.2%以有女性伴侣的女性身份出席。在参与者的病理方面，24%患有PCO, 8.7%患有输卵管病理，5.4%患有肌瘤，3.2%患有子宫内膜异位症和宫颈病理，比例相同。所有患者都遵循地中海饮食，只有三个参与者作为农民轻度接触有毒物质，如包装人员。我们记录了有害的习惯，如吸烟(17.4%的参与者)或偶尔饮酒(27%)。至于居住地，65.6%居住在特内里费岛，10.7%居住在拉帕尔马，10.7%居住在兰萨罗特，10.7%居住在富埃特文图拉，1.07%居住在戈梅拉，1.07%居住在耶罗。
男性参与者的平均年龄为38.2±5.2岁，平均BMI为27.4±4.3 kg/m2。
FF样品中金属的浓度随金属的不同而变化。最大程度高于仪器定量限的金属是Na(97.83%)、Fe(95.65%)和K(93.47%)，而Co、Mo、Cr、B、Cd、Li和V、Si、Hg未在该队列的FF样品中检测到。而那些信号低于仪器LOQ的样本在统计分析中不被考虑。这并不意味着它们不存在，因为它们可能低于设备的检测极限(ICP-OES)，这并不排除它们具有潜在危害[17]。
大元素金属Na、K和Ca的平均浓度(mg/kg)最高，其次是必需金属Fe、Zn、Cu和Mn。检测非必需金属Ba和Al(表2)。
表2 me联业制衣有限公司滤泡液中含有杂质
K与Fe、Zn呈正相关，与Na显著相关(r=0.7389;P < 0.001);Cu与Zn、Ba、Ca、Na呈正相关(与Ba相关性最高);Mn与Zn呈正相关。Ba与Cu、Zn呈正相关。
Al与Zn、Mn呈显著正相关。Na与Cu、Ca、K呈正相关，Zn与Mn、Ba、Al、K呈正相关(需要注意的是，Zn和Al的比值可能受到Al值过高的制约)。
Ca与Cu、Na呈正相关，与Fe呈负相关。这种负相关表明，当Pb含量增加时，Ca含量减少，这是因为Pb干扰了Ca的代谢，因为它们的化学性质相似，Pb通过取代Ca来起作用。Ni与任何金属都没有显示出显著的相关性(图2)。
图2
a) K-Fe, b) Na-K, c) Ca-Fe的相关性
22例(24%)有PCO。分析了PCO患者体内金属的存在。根据PCO，妇女的特征或金属的存在没有显著差异(表3)。
表3特征与我联业制衣有限公司内容根据PCO
根据约登指数对最接近显著性的金属使用截断点(表3)表明，Cu、Zn、Al和Ca的低值有利于PCO。该模型的AUROC为0.673 (95% CI 0.546;0.801;P=0.014)。
93名参与者中有2名没有成熟的卵母细胞，这意味着FR和CR是根据总共91次干预来计算的。卵母细胞的数量在1到33之间变化，每OPU的中位数为9 (5;13)。
卵母细胞数量与参与者年龄呈负相关(r=- 0.353;P=0.001)。成熟卵母细胞数与FR无相关性。
PCO参与者的平均卵母细胞数量为14.3(7.2)，显著高于非PCO女性组，后者的平均卵母细胞数量为8.3(5.1)。但卵母细胞数与成熟卵母细胞数差异无统计学意义(p=0.159)，有PCO组为2.1 (p=0.25)，无PCO组为1.4 (p=0.30)。
关于卵母细胞数量与金属的关系:铁(rs=0.303;p=0.003)和Ca (rs=- 0.276;p=0.007)和Al (rs=- 0.195;p=0.061)和Na (rs=- 0.174;P=0.095)接近显著性。
成熟卵母细胞数与铁的关系(rs=0.319;p=0.002)， Ca (rs=-0.307;p=0.003)， Na (rs=- 0.215;P=0.039);其次为Al (rs=- 0.198;P=0.057)。
中位FR为76.5% (52.6;92.3)。21名参与者(23%)为100% FR, 8名参与者(8.8%)FR低于33.3%，4名参与者(4.4%)FR为0%。成熟卵母细胞与受精卵母细胞的中位数差异为1 (0;3)，在0到12之间变化。
高Ca会影响FR，根据约登指数取截断点，得到≤176.62 (p值=0.011)。Ca高于176.62 mg/kg会降低FR(图3)。
图3
受肥率和钙水平
也就是说，如果p=FR≥75%的概率，则ln p/(1 - p)=- 1.495+2.406*(如果技术=ICSI) - 1.630*(如果Ca>176.6 mg/kg)。该模型的AUROC为0.687 (95% CI 0.564;0.810;P=0.004)。
计算至少有一个受精卵的组的CR。在这个数据集中，有四名参与者没有获得至少一个受精卵母细胞，因此有效干预的数量为87。77项干预措施(88.5%)达到100% CR，只有5名参与者(5.7%)的CR≤80%。
关于金属的可得性，在两个CR组之间没有发现任何显著差异。精子图的分类虽然不重要，但也值得注意。在<100%分裂组中，70%出现病理，而在100%胚胎分裂组中，这一比例为39% (p=0.090)。
对于Cu, Fe和Al，已经进行了一项研究，使用约登指数标准来确定可能的分界点，这可能具有重要意义。如果Fe≤7.525,Cu≤1.04,Al>0.31低于上述值，则更有可能达到100% CR，如果p=CR=100%的概率，则ln p / (1-p)=0.177+2.025*(如果Cu≤1.04 mg/kg) +1.448*(如果Al>0.31 mg/kg)。该模型的AUROC为0.799 (95% CI为0.648;0.951;P=0.002)。过量的铜和铝是有害的。
geq是从至少有一个受精卵的那一组，即87名参与者中获得的。它们的值在0到9之间变化，中位数为2 (1;18名(20.7%)参与者没有达到GEQ, 16名(18.4%)参与者达到了一个GEQ, 17名(19.5%)参与者达到了五个或更多的GEQ。一半的病例的GEQ率超过50%，25%的病例的GEQ率达到66.7%，尽管25%的病例的GEQ率低于20%。7名参与者达到100%的GEQ率(表4)。
表4特征与我联业制衣有限公司内容根据GEQ率
如果对最接近显著的金属采用约登指数判据，则Fe的截断点>10.043,Ca的截断点> 93.725。如果Fe>10.043，则GEQ小于66.6%。在逻辑回归模型中引入这两个变量(正向选择Wald变量)表明，过量的Fe(>10.043)和过量的Ca(> 93.725)会降低GEQ率。该模型的AUROC为0.627 (95% CI 0.569;0.815) p=0.006。
在本研究中，高Ca和Fe水平对GEQ有害。
在总周期中，87名受试者中有69名(79.3%)在第5-6天出现了至少一个培养胚胎的FR。培养胚胎的中位数为3个(1个;27名参与者(39.1%)为0% BR, 9名参与者(13%)为100% BR，中位数为33% (0;50)。
如果根据约登指数计算截断点，则可以得到，对于Ca和K，这些金属的过量会损害BR。使用这两个变量进行逻辑回归，只有K会留在模型中(Ca > 170.335, 94也有K > 304.7466 mg/kg)。
ROC曲线显示面积为0.641 (IC95% 0.503;0.779;P=0.030)。
48名参与者有冷冻胚胎，总共60个周期(其中12名参与者有两个冷冻周期)。中位数是75 (0;100)。在这60个周期中，17个(28.3%)未获得囊胚，28个(46.7%)100%获得囊胚。我们尝试形成<50%和≥50%的组，以及等于100%或不等于100%的组，但在这种情况下，不显著。
总共有129个周期(69个新鲜周期和60个冷冻周期)。中位BR为50% (0;100%)。44个循环(34.1%)BR为0%，37个循环(28.7%)BR为100%。
高钙、高钾处理使BR降低，低钙处理使BR提高。Mn的存在对BR有害，特别是BR≥50%时，91%的Mn≤0.035 mg/kg，而BR < 50%时只有67% (p=0.039)。
在总共110个周期中，至少移植了一个胚胎(69个新鲜胚胎中的52个，60个冷冻胚胎中的58个)。至少进行一个周期的参与者总数为80人，其中18人同时进行了新鲜和冷冻移植(ECT)， 34人只进行了新鲜移植，28人只进行了ECT。51人(63.7%)只有一个周期，28人(35%)有两个周期，只有1人(1.3%)有三个周期。
在62%的周期中，一个胚胎被移植，其余38%的周期中，两个胚胎被移植。这些比例在新鲜和ECT之间没有显著差异(p=0.653)(40%的周期移植了新鲜的两个胚胎，36%的周期移植了ECT)。
不同胚胎移植数的IR差异不显著(p=0.915)。在ECT的病例中，植入率为32.4%，而移植两个胚胎的病例为33.3%。在新鲜胚胎的情况下，一个胚胎移植的IR为25.8%，两个胚胎移植的IR为23.8% (p=0.870)，而在冷冻胚胎中，一个胚胎移植的IR为37.8%，两个胚胎移植的IR为42.9% (p=0.707)。
在110个胚胎移植周期中，74个周期(67.3%)未着床，33个周期(30%)植入1个胚胎，3个周期植入2个胚胎(2.7%)。尽管差异不显著，但新鲜胚胎的着床周期为13个(25%)，而冷冻胚胎的着床周期为23个(39.7%)(p=0.110)。
在新鲜胚胎和冷冻胚胎的技术方面没有发现差异，94%的新鲜胚胎和91%的冷冻胚胎使用ICSI (p=0.719)。
虽然不显著(p < 0.1)，但未植入的患者中约有15%出现Ba和Mg，而植入的患者中这一比例仅为3%(单周期)。
如果K>237.18, Ca≤147.32，有利于植入。该模型的AUROC为0.716 (95% CI为0.611,0.822);P < 0.001。该模型的总体准确率为74.5%(未植入组为83.8%，植入组为55.6%)。
在本研究中，高铁、高钾和低钙水平改善了IR。
在110个ET周期中，36个妊娠(其中2个为多胎妊娠)，其中13个(36.1%)来自新鲜周期，23个(63.9%)来自ECT。换句话说，在52个有ET的新鲜周期中，13个(25.0%)导致怀孕，而58个ECT周期中有23个(39.7%)导致怀孕(p=0.110)。在这36例妊娠中，27例(70.0%)进化为阳性(2例双胎妊娠)，8例(22.2%)以流产告终，1例为异位妊娠。在新鲜周期的情况下，13例妊娠中有10例(76.9%)进化为阳性(1例双胞胎)，而ECT有17例(73.9%)进化为阳性(1例也有双胞胎)(p=0.981)。
如果使用截断点(约登指数)的变量，最好区分怀孕成功。该模型的AUROC为0.741 (95% CI 0.539, 0.943)。
PR受高铁、高钾和低铜的影响。
ccDownload: /内容/ pdf / 10.1007 / s12011 - 023 - 03578 - 3. - pdf
