冠状病毒(CoV)膜(M)蛋白是组装过程中的驱动力，但这一过程的特征尚不清楚。先前，我们描述了中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV) M蛋白c尾的两个基序，涉及其内质网(ER)出口(211DxE213)和反式高尔基网(TGN)保留(199KxGxYR204)。在这里，通过两种不同的病毒样颗粒(VLP)测定和在传染性MERS-CoV cDNA克隆中突变这两个基序来研究它们在病毒组装中的功能。结果表明，199KxGxYR204基序在VLP和感染性病毒组装中是必需的。此外，由该基序突变引起的M蛋白错定位阻止了M - e相互作用。通过突变M的211DxE213基序来阻止其ER输出，仍然允许形成无核衣壳的VLPs，但阻止了完全组装的VLPs和感染性颗粒的形成。综上所述，这些数据表明MERS-CoV组装过程高度依赖于其M蛋白在细胞内的正确运输，因此，不仅特定的蛋白质-蛋白质相互作用基序，而且在感染细胞中M蛋白的正确亚细胞定位对病毒形成至关重要，在研究组装过程时应考虑到这一点。

　　冠状病毒发现于20世纪中期，在动物物种中与高发病率和死亡率相关[1,2]。在2002年之前，只知道引起轻度上呼吸道感染的人类冠状病毒，但随着高致病性严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)的爆发，这种情况发生了变化。此次疫情凸显了冠状病毒跨越物种屏障的内在能力，随着2012年致病性中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)和2019年SARS-CoV-2的出现，对人畜共患冠状病毒的担忧进一步加剧。

　　与其他冠状病毒相似，MERS-CoV具有一个非常大的约30.1 kb的正义RNA基因组，该基因组与核衣壳蛋白相关，形成螺旋状核糖核衣壳。这个核糖核衣壳核心被一个脂质包膜包围，其中嵌入了三种结构蛋白，即刺突(S)、膜(M)和包膜(E)蛋白。刺突蛋白(S)通过介导受体结合和病毒膜与宿主细胞膜的融合，负责病毒进入靶细胞[3,4]。最丰富的M蛋白参与病毒组装过程和免疫逃避[5,6]。小E蛋白在病毒生命周期中具有多种功能，特别是在组装和出口过程中，它作为病毒孔蛋白发挥作用[6,7,8]。E蛋白在病毒包膜中的数量通常很低[6,9,10]。N蛋白的主要作用本质上是结构性的，包括保护病毒基因组并确保其与颗粒的核糖核衣壳结合。然而，N蛋白还具有重要的非结构功能，通过与许多宿主细胞蛋白相互作用，从而调节各种细胞过程[11]。

　　冠状病毒的组装和随后的释放是病毒在个体内部或个体之间传播的关键决定因素，因此可能是治疗干预的一个有吸引力的目标。所有病毒粒子相关成分都是在内质网-高尔基中间室(ERGIC)膜的组装过程中获得的[12,13]。这一组装过程受到复杂的蛋白质-蛋白质相互作用的严格调控，以确保病毒颗粒所需的所有成分都聚集在ERGIC中并结合到病毒粒子中，然后通过(溶酶体)胞外作用释放出来[13,14,15,16]。M蛋白似乎是冠状病毒组装过程中的驱动力[17,18]。MERS-CoV M蛋白含有219个氨基酸，由一个短的n端外域(包含1个n -糖基化位点(N3))、三个跨膜螺旋和一个大的c端内域(占蛋白质的一半)组成。当单独表达时，冠状病毒M蛋白保留在高尔基复合体中[19,20,21]，尽管参与这种保留的高尔基区和M结构域在冠状病毒中是不同的[18,22,23,24,25,26]。MERS-CoV M蛋白通常保留在反式高尔基网络(TGN)中[27,28]，我们之前在c尾部发现了两个对单表达MERS-CoV M蛋白的运输很重要的基序。211DxE213基序需要在翻译时将M蛋白从内质网(ER)输出，而199KxGxYR204基序随后在TGN中保留M蛋白[27]。

　　虽然M蛋白是组装过程中的驱动力，但它们不能单独起作用，其他病毒蛋白，特别是E和/或N蛋白，还需要形成病毒样颗粒(vlp)[6,7,29,30,31,32,33,34,35,35,36,37,38,39,40]。对于大多数冠状病毒，S蛋白不参与VLP的形成，但似乎通过与M蛋白相互作用而被纳入病毒粒子[6,41,42]。到目前为止，复杂的组装过程是如何被精心安排的仍然难以捉摸[43]。本研究的目的是优化一种可靠的哺乳动物细胞VLP检测方法，作为MERS-CoV组装过程的功能测试，并评估199KxGxYR204-和211dxe213介导的细胞内M蛋白运输/定位对病毒组装是否必要。

　　将MERS-CoV M蛋白的编码序列克隆在pCDNA3.1(+)载体的BamHI和EcoRI限制性内切位点之间，并采用c端或n端v5标签，如上文所述[27]。使用Q5?High-Fidelity 2X Master Mix (New England Biolabs)和正向引物5′- cgggatcccaaatgcaactcactga -3′(n端v5标签)和反向引物5′- cagaattataagctcgaagcaaggca -3′(c端v5标签)或正向引物5′- tcggatccaccatgctcaaatggca -3′和反向引物5′- tagaattcagctcgaagcaagttcaat -3′(c端v5标签)，通过定点突变PCR产生MN3Q糖基化位点突变体。PCR产物插入到V5-pCDNA3.1(+)或pCDNA3.1(+)-V5质粒的BamHI和EcoRI酶切位点之间。

　　利用正向引物5′- cgggatcccaaatgacaccaactcactga -3′和反向引物5′- tagaattattattatatgtaaatgg -3′，PCR得到缺失M蛋白最后20个氨基酸的V5-MN3Q-?20ct突变体。融合PCR生成V5-MN3Q-211DxE213A和V5-MN3Q-199KxGxYR204A突变体。第一次PCR用正向引物5′- cgggatcccaaatggcaactcactga -3′和反向引物5′- caagtgcaatagccggtaagcggactc -3′对211DxE213A进行PCR，对199KxGxYR204A进行反向引物5′- cggactagcagcatagctgccgcatatcattagggtaaatggca -3′进行PCR。对211DxE213A用正向引物5′- acggcggcattgcattgcattgcattgcggcgg -3′进行PCR，对199KxGxYR204A用正向引物5′- agatatgcggctgctagtccgccattacggcgg -3′进行PCR，反向引物5′-cctactcagacaatgcgatg-3′进行PCR。用正向引物5′- cgggatcccaaatgacacactcacga -3′和反向引物5′- cagaattcctaagcgaagcaatgcaa -3′对两个构建体进行融合pcr。所有PCR产物均插入到V5-pCDNA3.1(+)载体的BamHI和EcoRI酶切位点之间。质粒序列经Sanger测序验证。

　　从法国里尔住院的一名MERS-CoV患者身上获得的MERS-CoV E和N蛋白的编码序列，被克隆在pCDNA3.1(+)载体的BamHI和EcoRI酶切位点之间，具有c端hsv标签编码序列。如前所述[27]，从感染患者的血液样本中提取RNA进行逆转录后获得cDNA，用于扩增蛋白质编码序列。首先，E用正向引物5′-atgttaccctttgtccaaga-3′和反向引物5′- ttaacccccgtcaggtg -3′扩增，n用正向引物5′- atggcatcctgctgcaccc -3′和反向引物5′-atcttgttactttgagtgac -3′扩增，将序列插入pCDNA3.1(+)表达载体的BamHI和EcoRI酶切位点之间。用正向引物5′- tcggatccaccatgttaccctttgtccaacgaa -3′扩增E，用反向引物5′- ccgaatacccactcgtcaggggtagagag -3′扩增N，用正向引物5′- tcggatccaccatggcatcagtgttaatatcatcatgg -3′扩增N。

　　包含MERS-CoV S密码子优化序列的pCAGGS-MERS-S由Gary Whittaker提供。随后将该序列插入pCDNA3.1(+)表达载体的BamHI和EcoRI酶切位点之间。

　　所有实验均使用Huh-7细胞，除了Huh-7- dpp4敲除(KO)细胞外，在VLPs中也评估了S蛋白的掺入。Huh-7和Huh-7- dpp4 - ko细胞在添加10%胎牛血清(FCS)和1%谷氨酰胺的DMEM中维持。

　　通过CRISPR-Cas9敲除Huh-7细胞中的DPP4，生成Huh-7-DPP4- ko细胞。为了生成sgRNA表达载体，我们将寡核苷酸5′-caccgaagagaataaactgccatc-3′和5′- aaacgatgggcagttattctcttc -3′退火后，经BbsI酶切后克隆到pSpCas9载体中。采用TransIT?-LT1转染试剂(Mirus Bio)，用1μg sgRNA表达载体和50 ng pPURO共转染六孔板中的Huh-7细胞，以获得对嘌呤霉素的抗性。用5μg/ml嘌呤霉素孵育细胞5天。然后从DPP4-KO群体中分离克隆，选择1个克隆进行VLP实验。

　　转染前16 h，将Huh-7或Huh-7- dpp4 - ko细胞以2 × 106个/皿的浓度转移到100 mm培养皿中。为了测试VLP形成的最低要求，使用TransIT?- lt1转染试剂(Mirus Bio)，用2μg M-V5或v5 - m编码质粒、1μg e - hsv编码质粒和3μg s编码质粒单独或相互联合转染Huh-7或Huh-7- dpp4 - ko细胞。使用空pcDNA3.1(+)载体，必要时将转染的DNA总量补全至6μg。为了检测突变M蛋白对V5-MN3Q(野生型)或突变M蛋白(V5-MN3Q-?20ct, V5-MN3Q- 211dxe213a和V5-MN3Q- 199kxgxyr204a或双突变V5-MN3Q- 199kxgxyr204a - 211dxe213a)的质粒和2μg e - hsv编码质粒，对hh -7细胞进行共转染。为了检测单次表达时野生型或突变型M蛋白的分泌情况，将2μg编码野生型或突变型M蛋白的质粒和2μg空pCDNA3.1(+)载体共转染细胞。当必须评估N的掺入时，使用较低的E浓度，导致2μg v5 - mn3q编码质粒，0.25μg E- hsv编码质粒和5μg N- hsv编码质粒的组合。用3μg S编码质粒测定S的掺入情况。

　　转染48小时后，收集上清(10 ml)，离心(150 g, a -4 - 62转子，Eppendorf, 5分钟，4°C)，通过0.45μm过滤器过滤。用冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗细胞两次，并用含有cOmplete?蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Roche)的RIPA缓冲液(50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% DOC, 0.1% SDS)在4℃下裂解1小时。将上清样品装在20%蔗糖缓冲垫(2ml)上，154,000 g (SW41Ti转子，Beckman)， 4℃离心3小时。细胞裂解液在18000 g(10分钟，4°C, FA-45-30-11转子，Eppendorf)离心，裂解液保存在- 20°C，直到进行western blot分析。上清液超离心后，将微球重悬于200μl TN缓冲液(20 mM Tris-HCl pH 7.4, 100 mM NaCl)中，并在- 80°C保存至western blot分析。

　　将TN缓冲液中的VLP微球和细胞裂解液重悬于Laemmli上样缓冲液中，并通过SDS-PAGE在12% (M, N和E)或8% (S)聚丙烯酰胺凝胶上分离。接下来，将蛋白质转移到硝化纤维素膜(Amersham)上，随后将膜在5% (w/v)脱脂干牛奶和0.1% (v/v)吐温-20的PBS中RT下阻断1小时。为了检测v5标记的M蛋白，将膜与单克隆抗v5抗体(ThermoFisher Scientific)在5% (w/v)脱脂奶粉中与0.1% (v/v) Tween-20的PBS中在4°C下孵育过夜。检测未标记M时，采用兔抗mers - cov -M多克隆抗体(Proteogenix)。检测E-HSV时，用多克隆山羊抗hsv抗体(Abcam)孵育过夜，检测N-HSV时用多克隆山羊抗hsv抗体(Abcam)或兔抗n抗体(Invitrogen)孵育过夜，检测S蛋白时用多克隆兔抗刺突抗体(Sino Biological)孵育过夜。用0.1% (v/v)吐温-20的PBS洗涤三次后，用hrp标记的山羊抗小鼠IgG抗体(v5标记的M蛋白)、驴抗绵羊IgG抗体(E或N蛋白)或山羊抗兔IgG抗体(S、N或未标记的M蛋白)(Jackson ImmunoResearch)在RT下孵育1小时，后冲洗三次。通过增强化学发光(Pierce?ECL, ThermoFisher Scientific)显示蛋白。

　　转染前16 h，将Huh-7-DPP4-KO细胞以2 × 106个/皿的浓度转移到100 mm培养皿中。用含2% FCS的DMEM代替细胞培养基。为了检测M + Ehigh + S VLPs，使用TransIT?-LT1转染试剂将2μg编码V5-MN3Q的质粒、1μg编码e - hsv的质粒和3μg编码S的质粒共转染细胞。为了检测M + Elow + N + S VLPs，使用TransIT?-LT1转染试剂将编码V5-MN3Q的质粒2μg、编码e - hsv的质粒0.25μg、编码N- hsv的质粒5μg和编码S的质粒3μg共转染细胞。转染48小时后，收集上清进行如上所述的VLP沉淀。将上清液(141,000 g, SW28Ti转子，Beckman)超离心后，将颗粒重悬于50μl PBS中，并加入50μl 8% PFA固定。Formvar/碳涂层镍网格在5分钟内沉积在一滴样品上，并在一滴水中冲洗两次。阴性染色用2%醋酸铀酰(琼脂科学，斯坦斯特德，英国)连续进行三个对比步骤，然后在透射电镜下分析(JEOL 1011，日本东京)。

　　含有全长传染性MERS-CoV cDNA的细菌人工染色体(BAC)，在本文中称为野生型BAC，由F. Almazan博士和L. Enjuanes博士提供[44]。BAC M突变体的构建使用中间pCDNA3.1(+)质粒，该质粒包含圆形野生型BAC的核苷酸35,422至261(因此包含E-M-N结构蛋白)，位于野生型BAC天然存在的SanDI (KflI)和SfiI限制位点之间。以中间体pCDNA3.1(+) -E-M-N质粒为模板，采用融合PCR方法获得199KxGxYR204A突变体。第一次PCR用正向引物5′- aagggtcccgtgtagaggctaatccat -3′和反向引物5′- cggactagcagcattagctgccgcatatctagggtaaatggca -3′进行。第二次PCR采用正向引物5′- agatatgcggcagctaaggctaggccccccccccccccccccccgccgttcgc -3′和反向引物5′- gtggcccggcaaggggttcgc -3′进行。用第一次PCR反应的正向引物和第二次PCR反应的反向引物进行融合PCR。将融合PCR产物插入pCDNA3.1(+)载体的SanDI和SfiI酶切位点之间，通过Sanger测序验证完整片段的序列。接下来，通过限制性消化和结扎将该片段引入野生型BAC。对211DxE213A构造使用了类似的方法。构建pCDNA3.1(+)- e - mdx - n中间载体，第一次用正向引物5′- aagggtcccgtgtagaggtaatccatt -3′和反向引物5′- caagtgcaatagccccccgccgccggccgggttccccc -3′进行PCR，第二次用正向引物5′- aagggtccccggccggcaaggggttccatt -3′和反向引物5′- aagggtccccggccggcaaggggttccatt -3′进行融合PCR。将融合PCR产物插入pCDNA3.1(+)载体的SanDI和SfiI酶切位点之间，通过Sanger测序验证完整片段的序列。

　　转染前16 h，以0.4 × 106个细胞/孔的浓度将Huh-7细胞接种于六孔板中。细胞共转染0.5μg编码V5-MN3Q(野生型)或突变型M蛋白(V5-MN3Q-?20ct, V5-MN3Q- 211dxe213a和V5-MN3Q- 199kxgxyr204a或双突变型V5-MN3Q- 199kxgxyr204a - 211dxe213a)的质粒和0.5μg e - hsv编码质粒(co-IP M -e)或0.5μg MN3Q-HSV (co-IP M -M)，使用TransIT?- lt1转染Reagent。空白载体用于对照条件，或必要时将总量填满至1μg。对于M-E co-IP，用PBS洗涤细胞，用甲醛处理(0.8%，RT下10分钟)交联蛋白质。之后，在裂解前用500 mM Tris-HCl pH 7.4在PBS中洗涤两次，用冷PBS洗涤一次。对于M-M - co-IP，不进行交联，裂解前用冷PBS洗涤细胞两次。在RIPA缓冲液(50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% DOC, 0.1% SDS)中进行M-E和M-M共ip实验，在4°C下裂解1小时。离心(18,000 g, 10分钟，4°C, FA-45-30-11转子，Eppendorf)后，裂解物在4°C下用蛋白g多糖珠孵育45分钟进行预清。随后将预先清除的裂解物分成两部分，一部分与山羊多克隆抗v5抗体(Abcam)孵育，另一部分与兔抗hsv抗体(Novus)孵育，在4℃下孵育3小时。同时，用1%的BSA在PBS中阻断蛋白G糖珠，用RIPA缓冲液洗涤2次，然后加入裂解物抗体悬液。在4℃下孵育1 h后，用含有cOmplete?蛋白酶抑制剂鸡尾酒的RIPA缓冲液洗涤5次，之后用含有2-巯基乙醇的Laemmli缓冲液洗脱蛋白，在95℃下加热10 min。洗脱液采用与上述VLP分析相同的抗体进行western blot分析。

　　western blots条带定量采用图像J及其条带定量函数。为了弥补表达水平的差异，计算VLP分泌的比率(=Mmedium/Mlysate + medium)，并绘制所有突变体相对于野生型M的曲线。在Co-IP实验中，计算相对于野生型M的Co-IP和IP信号，并将平均Co-IP信号(=(抗- hsv信号+抗- v5信号)/2)归一化为平均IP信号(=(抗- hsv信号+抗- v5信号)/2)，以考虑Co-IP信号对免疫沉淀效率和蛋白质总可沉淀量的依赖性。由于共沉淀样品中的E-HSV信号太弱，因此在M-E共沉淀实验中，只计算了共沉淀的V5-M信号，并相对于平均IP信号进行了绘制。

　　转染前16小时，以0.08 × 106个细胞/孔的浓度将Huh-7细胞接种于24孔板的盖片上。使用TransIT?-LT1转染试剂将编码V5-MN3Q或突变M蛋白的质粒与e - hsv编码质粒(共定位M -e)或mn3q - hsv编码质粒(共定位M -M)联合转染细胞，共转染250 ng质粒。转染16小时后，细胞用3%甲醛在PBS中固定20分钟，用0.1% Triton-X100在PBS中渗透3分钟，用10%正常马血清孵育15分钟，用10%正常马血清中抗v5单克隆抗体(ThermoFisher Scientific)孵育v5标记的M蛋白，然后用花青素-3偶联的驴抗小鼠IgG二抗孵育。用10%正常马血清中的多克隆兔抗hsv抗体(Abcam)标记hsv标记的蛋白，然后用Alexa Fluor?488偶联的驴抗兔IgG抗体进行标记。用多克隆羊抗人TGN抗体(BioRad)孵育，然后用Alexa Fluor?647偶联的驴抗羊IgG抗体孵育，可见反式高尔基体网络。细胞核用1μg/ml的4′，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)显影，盖片贴装于Mowiol?贴装培养基中。使用激光扫描共聚焦显微镜LSM 880(蔡司)，63 ×油浸物镜获得图像。使用ImageJ的JACoP插件计算Pearson相关系数。

　　将Huh-7细胞以1.3 × 104的密度接种于96孔白色微孔板(Thermo Fisher Scientific)。第二天，使用TransIT?- lt1转染试剂以100 ng/孔的浓度转染HiBiT-MN3Q、HiBiT-MN3Q-?20ct、HiBiT-MN3Q- 211dxe213a和HiBiT-MN3Q- 199kxgxyr204a的质粒。转染16小时后，取出培养基，每孔加入50μl不含FCS的DMEM。为了评估质膜表达，每孔加入含有50μl细胞外缓冲液、0.5μl lgb和1μl细胞外底物的混合物(Nano-Glo?HiBiT细胞外检测系统- promega)。通过添加含有50μl裂解缓冲液、0.5μl LgBiT和1μl裂解底物(Nano-Glo?HiBiT lytic Detection System-Promega)的混合物来评估总蛋白表达水平。荧光素酶活性测定采用Tristar LB941光度计(Berthold Technologies)。对于每个构建，计算质膜信号/总蛋白信号的比率，并绘制相对于野生型M.对于每种条件，取重复孔并重复实验至少三次。

　　使用TransIT?-LT1转染试剂(Mirus Bio)将1.2μg野生型或突变BAC构建物转染16小时前将Huh-7细胞转移到24孔中。转染24小时后，根据制造商的说明，为每个构建体收集重复的细胞孔，并使用NucleoSpin?RNA Plus试剂盒(machery - nagel?)提取RNA。对于每个构建，在转染后48 h，在Laemmli缓冲液中收集细胞裂解液，并在95°C下加热30分钟，通过western blotting观察M, E, N和S结构蛋白。用于免疫印迹的抗体如上所述，除了使用多克隆兔MERS-CoV-E抗体的抗e蛋白抗体(GeneTex)。其余孔在转染24 h后更换培养基，转染4 d后收集上清液进行感染性滴定，并固定细胞进行免疫荧光染色，使用兔抗mers - cov -M多克隆抗体(Proteogenix)可视化所有构建体的M定位。

　　采用实时定量RT-PCR技术对MERS-CoV基因组进行定量分析。简单地说，利用高容量cDNA逆转录试剂盒(Life Technologies)对RNA进行逆转录获得cDNA。采用定量RT-PCR检测MERS-CoV基因组。使用一对特异性引物(5′- caaaaccttccaagaagaag -3′和5′- gctccttggaggttcagacat -3′)和MERS-CoV-N蛋白序列特异性探针(5′- fam - accaaaggcaccaaaagaatcaacagacc -3′)进行扩增。将含有N蛋白编码序列的pCDNA3.1质粒转录生成的RNA用试剂盒制备标准曲线。在细胞RNA逆转录期间，平行地使用这些RNA的连续稀释。

　　BAC转染4 d后，收集细胞上清液，用感染性滴定法测定感染病毒的数量。因此，将Huh-7细胞接种于96孔板中，接种100μl 1/10连续稀释的上清(范围从10-1到10-8)。细胞与病毒稀释液在37°C和5% CO2条件下孵育5天。光镜下评估每孔CPE，确定50%组织培养感染剂量(TCID50)，并根据Reed和Muench法计算50%终点。

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